不同基因型鹅星状病毒鉴别诊断RT-PCR方法的建立

doi:10.16178/j.issn.0528-9017.20211154

浙江农业科学 ›› 2021, Vol. 62 ›› Issue (11): 2299-2302.DOI: 10.16178/j.issn.0528-9017.20211154

不同基因型鹅星状病毒鉴别诊断RT-PCR方法的建立

王宏宇¹^,²(), 朱寅初¹^,^*(), 云涛¹, 华炯钢¹, 叶伟成¹, 倪征¹, 陈柳¹, 张存¹

1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,浙江杭州 310021
2.南京农业大学动物医学院,江苏南京 210095

收稿日期:2021-02-26 出版日期:2021-11-11 发布日期:2021-11-04
通讯作者: 朱寅初
作者简介:朱寅初(1990-),男,浙江湖州人,助理研究员,博士,从事畜禽疫病防控研究工作,E-mail: zhuyinchu@zaas.ac.cn
王宏宇(1992—),男,山东潍坊人,博士,从事畜禽疫病防控研究工作,E-mail: wanghongyuwhy92@163.com。
基金资助:
浙江省重点研发计划(2019C02052);浙江农业科学院2020年度青年人才培养项目(10102000320CC300G/003/020)

Received:2021-02-26 Online:2021-11-11 Published:2021-11-04

摘要/Abstract

摘要：

鹅星状病毒(GAstV)是近年临床新发病原,也是导致当前雏鹅痛风致死的主要病因,研究显示该病毒存在两种不同基因型。为建立快速准确的核酸鉴别诊断方法,本研究针对不同基因型GAstV保守域RNA依赖性RNA聚合酶序列各设计1对特异性引物,建立以RNA为模板的双重一步法RT-PCR检测方法。条件优化试验结果显示,双重RT-PCR方法彼此无干扰;引物特异性强,对坦布苏病毒、鹅细小病毒、呼肠孤病毒、鸭瘟病毒的检测均为阴性;体系中引物适宜浓度为1 μmol,退火温度范围广,50~54 ℃皆可;敏感性高,最低检测限分别为10³拷贝数和10²拷贝数。对采集自江浙地区的73份样品进行检测,结果显示,鹅星状病毒阳性率为93.2%,主要为Ⅱ型星状病毒的单一感染(阳性率86.3%),部分样品呈现两种类型星状病毒混合感染现象(阳性率6.8%)。上述结果表明本研究建立的双重RT-PCR方法可用于GAstV的鉴别诊断和分子流行病学调查。

关键词: 鹅星状病毒, 一步法RT-PCR, 基因型, 检测方法

中图分类号:

S858.32

王宏宇, 朱寅初, 云涛, 华炯钢, 叶伟成, 倪征, 陈柳, 张存. 不同基因型鹅星状病毒鉴别诊断RT-PCR方法的建立[J]. 浙江农业科学, 2021, 62(11): 2299-2302.

图/表 8

表1 试验引物的基本情况

引物名称	引物序列5'-3'	片段/bp	毒株	登录号
GAstV I-F	GATACTTATGCTTCCACAAC	441	AHDY	MH410610.1
GAstV I-R	ATCTTGTTCAAAAGATGCTC
GAstV II-F	ACGACAGATGCGTTACTT	277	GD	MG934571.1
GAstV II-R	GGTGACATTATCCCTGAG

图1 鹅星状病毒RbRp核酸序列进化树

图2 单一PCR的扩增结果 M—DL1000;Ⅰ—基因Ⅰ型;Ⅱ—基因Ⅱ型;N—阴性对照;A—Ⅰ型核酸样本;B—Ⅱ型核酸样本。

图3 不同引物浓度对双重RT-PCR扩增的影响 M—DL1000;1—0.25 μmol·L-1;2—0.5 μmol·L-1;3—1 μmol·L-1;4—2 μmol·L-1;N—阴性对照。

图4 不同退火温度对双重RT-PCR扩增的影响 M—DL1000;1—50 ℃;2—52 ℃;3—54 ℃;4—56 ℃;5—58 ℃;6—60 ℃;N—阴性对照。

图5 双重RT-PCR的特异性 M—DL1000;1—GastV;2—TMUV;3—GPV;4—MDRV;5—DPV;6—AIV;N—阴性对照。

图6 双重PCR不同模板浓度的敏感性 M—DL1000;A—Ⅰ型单一PCR敏感性;B—Ⅱ型单一PCR敏感性;C—双重PCR敏感性;1~9—109~101拷贝·mL-1。

图7 部分临床样品的检测结果 M—DL1000;1~14—临床样品;N—阴性对照。

参考文献 18

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