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1.
【目的】细胞扩展蛋白(EXP)作为植物细胞壁的重要组成部分,参与种子萌发、营养器官发育、果实成熟、器官脱落、植物抗逆等植物生长发育过程中的多个环节。通过研究蜡梅细胞扩展蛋白基因CpEXP1启动子活性功能,为研究CpEXP1基因在蜡梅生长发育过程中的功能提供理论依据。【方法】以蜡梅‘磬口素心’为材料,通过hi-TAIL PCR法从蜡梅基因组DNA中克隆CpEXP1基因上游调控序列,利用生物信息学软件,分析CpEXP1基因启动子序列中潜在的顺式调控元件。构建该基因与GUS报告基因融合的植物表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法在烟草叶片中进行启动子活性的瞬时表达研究,并进一步利用花序侵染法在拟南芥中进行稳定表达,利用GUS组织化学染色和GUS报告基因的实时荧光定量PCR检测,分析CpEXP1基因启动子的活性。【结果】获得了长度为2 485 bp的蜡梅细胞扩展蛋白基因CpEXP1上游调控序列(GenBank Accession:MG452931),序列分析表明该启动子中除含有核心元件TATA-box和CAAT-box外,还包含多个与植物非生物胁迫及组织特异表达相关的顺式作用元件。在烟草中的瞬时表达分析表明该启动子具备驱动报告基因GUS表达的功能。进一步对转基因拟南芥植株的GUS组织化学染色和GUS基因表达分析结果显示,CpEXP1基因启动子在转基因拟南芥种子萌发初期活性较强,在子叶以及幼苗真叶中未检测到GUS活性;在花和根中活性较弱;在成熟叶片中可以检测到GUS活性,特别是在衰老叶片叶柄脱落区表达强烈。此外,该启动子在幼果中具有较强活性,随后启动活性逐渐下降,成熟果荚中仅在果柄脱落处能够检测到GUS活性。同时,转基因拟南芥植株中的CpEXP1基因启动子活性受高温(42℃)、低温(4℃)和水杨酸(SA)诱导,特别是对低温胁迫响应强烈,在4℃低温处理后,转基因拟南芥叶片中GUS基因的表达量是处理前的的8.7倍。【结论】CpEXP1基因启动子在转基因拟南芥不同发育阶段、不同器官中的活性具有明显差异,推测该启动子可能在种子发芽、叶片脱落以及果实脱落中发挥作用,同时CpEXP1基因启动子活性可被不同非生物胁迫诱导,可能参与植物抵御非生物胁迫的调控途径。 相似文献
2.
《西部林业科学》2019,(5)
真核生物翻译起始因子(eIF1)对逆境响应具有一定正响应;启动子能有效预测基因功能。以本研究鉴定获得核桃eIF1A基因(即JreIF1A)为其上游启动子,通过生物信息学、瞬时转化及GUS活性测定等不同技术,分析JreIF1A启动子的基本生物功能。结果显示,JreIF1A上游1 200bp启动子序列中包含众多与逆境响应相关的元件,病害响应相关的BIHD1OS、热胁迫响应相关的CCAATBOX1、Dof转录因子识别的DOFCOREZM、WRKY识别的WRKY71OS等。将JreIF1A启动子瞬时转入烟草测定GUS酶活性,发现JreIF1A启动子具有表达活性,且受干旱、盐、寒、热等胁迫诱导。表明JreIF1A启动子具有逆境响应表达活性,可能调控JreIF1A基因参与多重逆境响应。 相似文献
3.
杨树皮储藏蛋白基因启动子的克隆和功能研究 总被引：17，自引：0，他引：17
杨树树皮储藏蛋白BSP是类似种子储藏蛋白的氮素储藏物 ,冬季在韧皮部薄壁细胞中大量积累 ,是落叶树氮代谢中的重要成分。为了研究BSP基因启动子在转基因植物中的表达特性 ,探索其在植物基因工程研究中潜在的应用价值 ,我们用PCR方法从美洲黑杨基因组中DNA扩增得到了BSA启动子片段。与GUS基因融合构建中间载体后 ,转化烟草 ,获得了一批PCR检测为阳性的转化再生植株。经GUS组织化学检测 ,发现若干转基因烟草的茎和叶柄韧皮部以及叶脉都呈GUS染色阳性 ,初步证明杨树BSP基因启动子确有韧皮部表达特性 ,可介导GUS基因在转基因烟草韧皮部特异表达。 相似文献
4.
《林业科学》2017,(9)
【目的】植物促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)在响应生物与非生物胁迫中发挥重要作用。本研究通过分析桑树(川桑)B家族MAPK基因MnMAPK5的亚细胞定位和启动子活性,并将其转入拟南芥中进行过表达研究,探讨MnMAPK5在逆境胁迫下的作用机制。【方法】将MnMAPK5的上游启动子连接到p BI121载体上,通过花粉介导法转入拟南芥中,经高温、低温、NaCl和PEG处理后进行GUS染色分析。通过构建过表达载体,将MnMAPK5转化到拟南芥中,用T3转基因植株进行抗逆境胁迫分析。【结果】MnMAPK5基因的编码蛋白定位于细胞质和细胞核中。在拟南芥中检测MnMAPK5启动子驱动的GUS活性的结果显示,MnMAPK5启动子活性受到了高温、低温、高盐和干旱胁迫的诱导。在高盐、干旱、低温和H_2O_2处理条件下,过表达MnMAPK5抑制了转基因拟南芥的萌发和生长。在盐胁迫下,过表达MnMAPK5提高了转基因植株中的MDA含量和POD活性,降低了CAT活性、可溶性糖含量和H_2O_2含量;在干旱胁迫下,过表达MnMAPK5提高了转基因拟南芥中的MDA和H_2O_2含量,降低了CAT和POD活性;在低温下,转基因拟南芥相比野生型植株表现出更低的CAT活性、POD活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量;在氧化环境胁迫下,转基因拟南芥的MDA含量显著高于野生型拟南芥,而脯氨酸含量和可溶性糖含量要低。此外,在各个胁迫环境条件下,AtPOD、AtCAT和AtRD22等胁迫相关基因的表达量在转基因植株低于野生型拟南芥。【结论】MnMAPK5启动子在转基因拟南芥中的活性受到了不同非生物胁迫的诱导。过量表达MnMAPK5降低了拟南芥对非生物胁迫的抵抗能力,表明MnMAPK5在逆境胁迫下起着负调控作用。 相似文献
5.
以毛果杨叶片cDNA为模板,采用PCR技术分离出杨树ZFL基因,序列分析结果表明该基因序列开放读码框315 bp,共编码104个氨基酸,推导的蛋白质分子量为11.202 kDa,理论等电点9.83,命名为PtrZFL.对ZFL基因进行实时荧光定量PCR表达分析,结果表明:甘露醇、NaCl、H202、ABA、低温胁迫都能诱导PtrZFL基因的表达,且PtrZFL表达量在ABA处理3h时达到最高,然后随处理时间延长而逐渐降低;低温(4℃)胁迫在6h后能显著诱导PtrZFL基因表达,并随着低温处理能一直保持较高水平的表达.根据毛果杨基因组信息设计引物,获得了PtrZFL基因上游1000bp的启动子序列,序列分析结果表明该启动子包含有多个与胁迫相关的元件,如抗冻、缺水、抗寒、脱落酸响应元件ABRE、MYB和WRKY.GUS活性检测发现,该启动子在转基因拟南芥整株中都有表达,但在根部和成熟叶片中表达较强,其他位置表达微弱. 相似文献
6.
[目的]本研究拟从刚毛柽柳(Tamarix hispida)中克隆获得1个ThCBL4基因,研究该基因的耐盐功能。[方法]以"Calcineurin B-like protein"作为关键词,对实验室前期构建的刚毛柽柳转录组序列进行比对查找获得ThCBL4基因c DNA序列,并通过RT-PCR和测序验证克隆获得的ThCBL4基因序列。利用生物信息学工具进行序列分析。利用Real time RT-PCR分析了0.4 mol·L-1NaCl、20%(w/v)PEG6000和100μmol·L-1ABA胁迫处理后ThCBL4基因在刚毛柽柳根和叶中的表达情况。为了进一步分析ThCBL4基因的耐盐功能,构建了植物过表达载体pROKⅡ-ThCBL4,抑制表达载体p FGC5941-ThCBL4,并进行柽柳瞬时转化,同时以pROKII瞬时侵染柽柳作为对照。分析比较NaCl胁迫后瞬时转化柽柳POD、SOD酶活性、MDA含量和DAB、NBT及Evans blue染色情况,以综合评定ThCBL4基因的耐盐功能。[结果]ThCBL4基因c DNA长度为1 432 bp,编码区长度675 bp,编码224个氨基酸,编码蛋白分子量为25.57 k Da,理论等电点为5.0。3种不同环境处理后,ThCBL4基因在刚毛柽柳根中均为上调表达,在刚毛柽柳叶中均为下调表达。对盐胁迫后瞬时表达柽柳ThCBL4基因的表达分析显示,成功获得瞬时过表达(标记为OE)、抑制表达(标记为RNAi)转基因株系。进一步的生理指标和生理染色结果显示,盐胁迫下过表达ThCBL4植株的保护酶类SOD与POD活性明显高于对照和抑制表达株系。NBT和DAB染色结果显示,过表达植株的O·-2和H_2O_2含量明显低于对照,抑制表达植株的O·-2和H_2O_2含量明显高于对照;而Evans blue染色和MDA含量测定结果显示,与对照相比,过表达ThCBL4植株着色更浅、MDA含量更低,而抑制表达ThCBL4植株着色更深、MDA含量更高。[结论]ThCBL4基因可能参与了刚毛柽柳的耐盐胁迫应答,瞬时过表达ThCBL4基因通过提高植株的保护酶活性,降低活性氧氧化程度和细胞损伤的程度,从而提高了转基因刚毛柽柳的耐盐能力。 相似文献
7.
启动子在基因表达调控中起关键性作用,它在很大程度上决定所控基因表达的时间、空间和强度。依据拟南芥ATH1芯片分析杨树维管形成时期特异表达基因的结果,选取了差异表达基因NST3,通过BLAST比对在杨树EST数据库(PopulusDB)中找到同源性较高的基因NAC068。以毛白杨为材料,在其基因组中克隆得到该基因5'侧翼区901 bp长的片段,命名为pProNAC068,将该片段置换pBI121载体中的CaMV35S启动子,并在84K杨中检测报告基因GUS的表达情况。经过GUS活性检测分析发现:该启动子可以控制外源基因在次生维管组织中特异表达,从而为基因工程中有目的的控制外源基因在维管组织中的表达奠定基础。 相似文献
8.
为了分析AP1的表达调控模式,本研究克隆了拟南芥花异常株系AFDL的AP1启动子,启动子元件预测结果表明:AP1启动子中含有3个结合MADS调控因子的CArG box(从5'依次编号为CArG1、CArG2、CArG3),通过删减AP1启动子长度以及改变CArGbox数量构建了5个GUS表达载体并转化野生型拟南芥.测序结果显示:AFDL的AP1启动子在核苷酸序列上与野生型拟南芥完全一致,这表明AP1在AFDL中的表达显著降低并不是启动子序列突变引起的;转基因植株的GUS表达模式说明了CArG1在花发育早期及后期激活基因的表达,CArG2在整个后期都对基因的表达有抑制作用,而CArG3在花发育初期就能抑制基因的表达,并且在中后期仍然保持了对下游基因的抑制作用,CArG box1、2、3对AP1的表达有显著但非决定性的影响.此外,还推测在AP1启动子0～-3 579 bp范围之外存在影响AP1在第4轮花器官表达的调控元件,-3 579 bp至-1 752 bp区域可促进AP1的表达,而AP1启动子-1759 bp至-1359 bp区域除CArG2外的其它元件对调节其表达无明显作用. 相似文献
9.
白桦HSFA4转录因子的克隆及耐盐功能分析 总被引：2，自引：0，他引：2
《林业科学》2020,(5)
【目的】热激转录因子(HSF)在植物对非生物胁迫应答中起重要的调节作用。本研究拟从白桦中克隆获得HSFA4基因(命名为BpHSFA4),研究该基因的抗逆功能,为该基因用于林木基因工程育种奠定理论基础。【方法】在白桦转录组中筛选获得1条HSFA4基因,通过RT-PCR克隆获得BpHSFA4基因序列。利用生物信息学工具进行序列分析。利用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)分析不同逆境胁迫下BpHSFA4基因在白桦叶、茎和根中的表达模式。构建植物过表达载体pROKⅡ-BpHSFA4和抑制表达载体pFGC5941-BpHSFA4,进行白桦瞬时转化,同时以pROKⅡ瞬时侵染白桦作为对照。分析NaCl胁迫下不同瞬时转化白桦株系的MDA、H_2O_2、SOD、POD、相对电导率及二氨基联苯胺(DAB)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)及伊文思蓝(Evans blue)染色情况,以综合评定BpHSFA4基因的耐盐功能。【结果】BpHSFA4基因cDNA全长为1 170 bp,编码389个氨基酸,编码蛋白的相对分子量为44.15 kDa,理论等电点为5.14,具有典型HSF结构域。非生物胁迫(NaCl、PEG_(6000)、镉、高温和低温)条件下和激素(ABA、GA_3和JA)处理下,BpHSFA4基因的表达均发生了不同程度的改变,且每种处理后至少有1个时间点发生了明显上调或者下调,其中盐胁迫下表达变化尤为明显。3种瞬时表达白桦株系中的BpHSFA4基因的表达分析结果显示成功获得了瞬时过表达转基因株系(OE)和抑制表达转基因株系(SE)。进一步对不同转基因白桦株系的生理指标和生理染色进行分析,结果显示:Na Cl胁迫条件下,过表达BpHSFA4植株H_2O_2含量、MDA含量和相对电导率明显低于对照植株,抑制表达BpHSFA4植株的H_2O_2含量、MDA含量和相对电导率则明显高于对照植株;过表达BpHSFA4植株的SOD活性和POD活性明显高于对照植株,而抑制表达BpHSFA4植株的SOD活性和POD活性明显低于对照株系;NBT、DAB染色结果与H_2O_2含量测定结果一致,显示OE植株的着色明显比对照植株浅,而抑制表达株系着色明显比对照植株深,Evans blue染色结果和MDA含量测定结果一致。【结论】BpHSFA4基因能对非生物胁迫(NaCl、PEG_(6000)、镉、高温和低温)和激素(ABA、GA_3和JA)处理做出应答,特别是盐胁迫条件下,应答强烈,该基因可能参与白桦耐盐胁迫应答。在盐胁迫条件下,瞬时过表达BpHSFA4基因株系能通过提高SOD和POD等保护酶的活性从而增强活性氧清除能力、降低膜脂氧化程度,减少细胞受损或细胞死亡,进而提高白桦的耐盐能力。本研究初步证实BpHSFA4基因是一个耐盐胁迫应答候选基因。 相似文献
10.
[目的]在白桦(Betula platyphylla Suk)中鉴定抗非生物胁迫bZIP基因,为研究白桦抗逆性状形成的分子基础及抗性遗传改良提供数据和材料。[方法]从白桦苗克隆白桦bZIP基因,利用生物信息学对该基因进行系统进化分析。利用瞬时转化法进行快速基因功能分析,通过组织化学染色和生理指标测定鉴定抗旱耐盐功能。利用酵母单杂交初步鉴定转录因子与元件的结合。[结果]获得白桦bZIP基因,命名为BpbZIP1,其与已知抗性相关基因蛋白序列聚为一组。BpbZIP1基因受NaCl处理的诱导,在甘露醇处理下,表达变化不明显。在NaCl胁迫条件下,转基因株系清除活性氧的能力强于野生型,SOD和POD活性提高;在甘露醇胁迫条件下,转基因株系活性氧清除能力与野生型差别不明显,SOD活性升高,POD活性上升不显著。BpbZIP1能够与ABRE元件特异性结合。[结论]BpbZIP1基因能够通过清除活性氧来提高白桦瞬时转化株系的耐盐能力,抗旱能力不明显。鉴定出具有耐盐能力的白桦bZIP基因及其结合元件,为进一步分析白桦bZIP基因的耐盐分子调控机制提供基础数据。 相似文献