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1.
大豆叶绿体转化载体pJY系列的构建及其在烟草上的转化研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为解决杂交大豆(Glycinemax)制种过程中不育系易与保持系混杂的问题,开展了大豆叶绿体转基因的研究。通过转基因方法在不育系的细胞质中植入筛选标记基因,以区分不育系和保持系。根据已发表的大豆叶绿体序列(GenBankX07675)设计引物,用PCR方法获得两段大豆叶绿体同源重组序列LHRR和RHRR,克隆到质粒pUC19中,并将来源于质粒pTF102的壮观霉素抗性基因aadA克隆到两段同源重组序列之间,以构建大豆叶绿体转化表达载体pJY01。aadA基因的启动子Prrn和终止子psbA基因3′序列,分别从烟草叶绿体基因组中扩增而来。在此基础上,将草丁膦抗性基因或绿色荧光蛋白与GUS的融合蛋白基因克隆到该载体上,得到pJY03与pJY04,并初步应用于烟草(Nicotianatobacum)的叶绿体转化,获得了具壮观霉素抗性的绿色愈伤和幼苗,PCR扩增出aadA基因的条带,并在激光共聚焦扫描下检测到GFP的表达。 相似文献
2.
寿惠霞 《农业生物技术学报》2006,14(6)
杂交大豆是我国具自主知识产权的科研成果，具有广阔的应用前景。为解决杂交大豆制种过程中不育系易与保持系混杂的问题，我们开展了大豆叶绿体转基因的研究，目的是通过转基因的方法在不育系的细胞质中，植入筛选标记基因，以区分不育系和保持系。根据已发表的大豆叶绿体序列（GenBank X07675）设计引物，用PCR方法获得两段大豆叶绿体同源重组序列LHRR和RHRR，克隆到质粒pUC19中，并将来源于质粒pTF102的壮观霉素抗性基因aadA克隆到两段同源重组序列之间，以构建大豆叶绿体转化表达载体pJY01。 aadA基因的启动子Prrn和终止子psbA基因3’序列，分别从烟草叶绿体基因组中扩增而来。在此基础上，我们还将草丁膦抗性基因或绿色荧光蛋白与GUS的融合蛋白基因克隆到该载体上，得到pJY03与pJY04，并初步应用于烟草的叶绿体转化，获得了具壮观霉素抗性的绿色愈伤和幼苗，PCR扩增出aadA基因的条带，并在激光共聚焦扫描下检测到GFP的表达，由此证实了这一实验思路的可行性，为后期大豆叶绿体转化工作的顺利进行打下了良好的基础。 相似文献
3.
PHAs合酶phaC2基因转化烟草叶绿体的研究 总被引：3，自引：0，他引：3
中长链羟基脂肪酸聚酯 (medium-chain-length-PHAs, mcl-PHAs) 属于微生物聚酯。Ⅱ型PHA合酶是mcl-PHAs生物合成途径中的关键酶。将编码Ⅱ型PHA合酶的基因phaC2与水稻(Oryza sativa )叶绿体psbA基因的启动子和终止子构建表达盒(RpsbA-pro-phaC2-RpsbA-ter)，连同壮观霉素抗性基因aadA表达盒(prrn-aadA-TpsbA-ter)一起克隆进烟草叶绿体基因组同源片段rbcL和accD中，构建了烟草叶绿体转化表达载体pTC2。基因枪法转化烟草(Nicotiana tobacum L.)叶片，获得具有壮观霉素抗性的转基因烟草。对T0代和T1代转基因植株的PCR和Southern blot鉴定结果表明, 外源基因确已整合进烟草叶绿体基因组中，T1代转基因植株已达同质化。RT-PCR分析结果证实phaC2基因已在转录水平上表达。转基因植株的正反交试验证明外源基因在转基因后代中遵循母性遗传规律，不存在转基因的花粉漂移现象。通过叶绿体遗传转化, 实现中长链羟基脂肪酸聚酯合成关键酶基因phaC2在烟草叶绿体基因组中的稳定转化。 相似文献
4.
根据拟南芥叶绿体基因组序列设计PCR引物,从我国甘蓝型油菜栽培品种F4叶绿体基因组中克隆了长度为1.5kb的trnI和trnA2个基因序列,核酸序列分析表明它们与拟南芥基因的同源性高达94%和99%,这两个克隆的油菜叶绿体基因组序列trnI和trnA被用于构建叶绿体定点整合表达载体。利用烟草叶绿体基因强启动子Prrn和终止子TpsbA,以及筛选标记基因aadA和目的基因HSA,构建了多顺反子表达盒Prrn-aadA-HSA-TpsbA,将表达盒置于油菜叶绿体trnI和trnA序列之间,最后构建成油菜叶绿体多顺反子定点整合表达载体pIPaHTA。酶切鉴定及序列分析证实,构建的表达载体具有预期的调控元件及结构,这为后期油菜叶绿体转化体系的建立奠定了基础。 相似文献
5.
本研究利用质体基因组的进化保守性，根据烟草质体基因组全序列设计引物，从甘薯（lpomoea batatas L．）质体基因组中克隆了两个相邻的功能基因rbcL（GenBank登录号为AY942199）和HaccD（GenBank登录号为AY942200），以此作为定点整合外源基因的同源重组片段。选用水稻质体基因组强启动子prm及psbA3’非翻译区调控选择标记基因aadA和报告基因gfp，构建多顺反子表达盒prm—aadA-gfp-psbA-3＇，之后将表达盒克隆进甘薯质体同源片段中，获得甘薯质体多顺反子定点整合表达载体pSAG，酶切鉴定结果表明所构建的载体符合预期设计。这为后期甘薯质体转化体系的建立和通过质体基因工程手段将更多目的基因导入甘薯进行遗传改良奠定了基础。 相似文献
6.
拟南芥低温诱导cor15a基因的启动子克隆及在转基因马铃薯中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)品种Columbia的基因组中扩增出低温诱导基因cor15a的启动子片段并插入克隆载体。序列分析表明，克隆的启动子长900bp，与目前已经发表的启动子序列完全一致。将此启动子插入pBI121的gus基因及NOS终止子上游构成表达载体pLB，通过直接法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，并转化马铃薯(Solarium tuberosum)获得转化再生植株。再生植株PCR检测和PCR-Southern鉴定结果证明，cor15a基因启动子已经成功地转入到马铃薯植株基因组中。GUS组织染色证明拟南芥cor15a启动子在马铃薯中也同样具有低温诱导表达的能力。 相似文献
7.
猪霍乱沙门氏菌C500株crp-/gfp+缺失株的构建及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为研究crp（cAMP受体蛋白）基因缺失及插入绿荧光蛋白基因gfp后对猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500株的毒力及免疫原性的影响,同时为下一步构建以crp基因缺失C500为载体的外源基因-猪霍乱沙门氏菌双价口服疫苗奠定理论基础与技术基础,本文构建了C500株的crp缺失并插入gfp基因的crp-/gfp+缺失株。首先构建含缺失320bp的crp基因并插入gfp基因的重组自杀性质粒,与C500接合转移,两步法筛选无抗性的crp-/gfp+缺失株,经PCR和荧光显微镜观察证实在C500的基因组上缺失crp基因并正确插入gfp基因。 相似文献
8.
为了降低bFGF（basic fibroblast growth factor）的生产成本,结合植物生物反应器的优点,就bFGF在转基因苜蓿中的表达进行了探索。将bFGF插入植物表达载体pBⅡ21中,获得了含有bFGF基因的植物表达pBIcbFGF,再将pBIcbFGF利用冻融法转到农杆菌中。利用农杆菌介导法将基因转化保定苜蓿,转基因苜蓿在TM-1培养基＋20mg／L卡那霉素（Kan）＋200mg／L特美汀（Tim）中诱导分化,在生根培养基中生根,获得再生植株。再生植株通过PCR检测、RT—PCR及Western blot证实外源基因已经在苜蓿中成功表达。获得含有目的蛋白的阳性植株。为苜蓿作为植物生物反应器生产bFGF奠定了理论及技术基础。 相似文献
9.
朱睦元 《农业生物技术学报》2008,16(1)
植物反应器生产药品成本低,具有改变传统制药方法的光明前景。本研究 以PCR法克隆的大熊猫生长激素基因Am-GH,构建了原核表达载体pEGX-AmGH和植物表达载体pCAMBIA13011-GH。pEGX-AmGH转化E. coli得到高效表达。pCAMBIA13011-GH通过根癌农杆菌GV3101的介导转化烟草无菌叶片外植体,经过四轮潮霉素(Hygromycin, Hyg)递增筛选,获得抗性植株。其中部分Hyg抗性植株经GUS和PCR检测为阳性。鉴定结果表明Am-GH 已成功整合到烟草基因组中。为进一步探讨大熊猫生长激素基因Am-GH在烟草中的表达奠定了基础。 相似文献
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农杆菌介导的洋桔梗遗传转化体系的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
以洋桔梗叶片为外植体,建立了植株再生体系,并在此基础上,用根癌农杆菌介导法,研究了影响洋桔梗转化的若干因素。结果表明,诱导最佳培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.15mg/L,不定芽诱导率达74.5%;不定芽生根培养基为1/2MS+IBA 0.5 mg/L,生根率达90%。不定芽分化阶段和生根阶段的Km筛选浓度分别为45mg/L和15mg/L;根癌农杆菌菌液浓度OD600值为0.6,侵染时间10min,共培养时间3d,有利于抗性芽的产生。Km筛选得到的抗性植株经过PCR和Southern检测表明,八氢番茄红素合成酶基因(PSY)已经整合到洋桔梗基因组中。 相似文献
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番茄中反义ACC合成酶基因的导入与乙烯生物合成的控制 总被引：20，自引：0，他引：20
利用农杆菌ＬＢＡ４４０４携带反义ＡＣＣ合成酶基因和卡那霉素抗性基因，采用叶盘法转化番茄栽培品种“丽春”子叶，通过组织培养获得了能在卡那霉素培养基上生长的再生植株并进一步培养获得了延缓成熟和衰老的番茄果实。经过ＤＮＡ杂交和ＲＮＡ杂交检测，证明反义ＡＣＣ合成酶基因已插入番茄基因组中，并顺利地表达。 相似文献
12.
抗除草剂基因导入早稻（Oryza sativa）栽培品种 总被引：2，自引：0，他引：2
以生产上优良旱稻(Oryza sativa L．)新品种旱稻297、旱稻10号等的幼胚愈伤组织为转化受体材料,用基因枪法把抗Basta除草剂的bar基因导入了这些品种的愈伤组织,经两轮Basta抗性筛选和分化获得了再生植株,对再生植株进行PCR扩增和Southern杂交检测,T0和T1代Basta抗性实验表明,bar基因已整合到旱稻的基因组DNA中,并在T1代继续表达。对各品种幼胚培养的诱导、分化培养基实验表明,MB和MS培养基可作为这5个品种的愈伤组织诱导培养基,改良的RMB2、RMS2培养基可显著地提高愈伤组织的分化频率。实验所获得的转基因植株和建立的遗传转化系统。为早稻的抗除草剂分子育种和其它基因转化奠定了初步的基础。 相似文献
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以大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)生长激素基因AmGH构建到植物表达载体pCAMBIA13011-GH上,用根癌农杆菌(Agrobacterium turaefacicas)GV3101介导转化烟草(Nicotiana tabacum)无菌叶片外植体,经过两轮潮霉素(hygromycin,Hyg)筛选,从50株再生植株中筛选到12株抗性植株,经GUS组织化学检测和PCR鉴定,其中4株为阳性,表明AmGH基因已成功地转化并整合到烟草基因组中,RT-PCR检测表明,大熊猫生长激素基因AmGH已在转基因烟草中表达.这是首次报道大熊猫生长激素基因在植物系统中表达. 相似文献
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以爬行卫矛(Euonymus fortunci var.radicans)无菌苗下胚轴为外植体,在附加不同浓度植物生长调节剂的MS基础培养基上诱导培养,通过器官直接发生途径获得再生植株.结果表明,0.5 mg/LBAP和0.01 mg/L NAA组合的诱导效果最佳,其不定芽再生率高达92%,外植体平均不定芽数目为4.2个.将含有雪花莲凝集素基因(Galanthus nivalis agglutinin,GNA)的植物表达载体pBCGm导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404,通过农杆菌介导法遗传转化爬行卫矛的下胚轴,经PCR和PCR-Southern检测,GNA基因已整合到转化植株的基因组中.遗传转化过程中,外植体不经预培养,菌液浓度OD=0.6,共培养3 d,有利于获得最高遗传转化效率. 相似文献
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以爬行卫矛(Euonymus fortunei var. radicans)无菌苗下胚轴为外植体,在附加不同浓度植物生长调节的MS基础培养基上诱导培养,通过器官直接发生途径获得再生植株。结果表明,0.5mg/L BAP和0.01mg/L NAA组合的诱导效果最佳,其不定芽再生率高达92%,外植体平均不定芽数目为4.2个。将含有雪花莲凝集素基因(Galanthus nivalis agglutinin,GNA)的植物表达载体pBCGm导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404, 通过农杆菌介导法遗传转化爬行卫矛的下胚轴,经PCR和PCR-Southern检测,GNA基因已整合到转化植株的基因组中。遗传转化过程中,外植体不经预培养,菌液浓度OD=0.6,共培养3d,有利于获得最高遗传转化效率。 相似文献
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刘锡娟 《农业生物技术学报》2007,15(6)
林敏教授课题组从具有草甘膦抗性的荧光假单胞菌G2中克隆了EPSP合酶基因aroAG2，根据aroAG2的氨基酸序列，按照双子叶植物偏爱密码子人工合成aroAG2M基因。我们利用aroAG2M基因和Impactvector1.4，构建了以菊花Rubisco启动子和叶绿体信号肽驱动aroAG2M基因高效表达的植物表达载体Pim1.4-epsps-plus，以农杆菌介导法转化烟草，转基因烟草经PCR和Southern检测，证明外源基因已整合到基因组中，转基因烟草具有草甘膦抗性。以花粉管通道法转化棉花，经草甘膦抗性筛选得到T1代转基因棉花3株，转基因棉花的PCR和Southern检测结果均为阳性，说明目的基因已通过花粉管通道法导入棉花。 相似文献
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摘要：以生产上优良旱稻（Oryza sativa L. ）新品种旱稻297、旱稻10号等的幼胚愈伤组织为转化受体材料，用基因枪法把抗Basta除草剂的bar基因导入了这些品种的愈伤组织，经两轮Basta抗性筛选和分化获得了再生植株，对再生植株进行PCR扩增和Southern杂交检测，T0和T1代Basta抗性实验表明，bar基因已整合到旱稻的基因组DNA中，并在T1代继续表达。对各品种幼胚培养的诱导、分化培养基实验表明，MB和MS培养基可作为这5个品种的愈伤组织诱导培养基，改良的RMB2、RMS2培养基可显著地提高愈伤组织的分化频率。实验所获得的转基因植株和建立的遗传转化系统，为旱稻的抗除草剂分子育种和其它基因转化奠定了初步的基础。 相似文献
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由根癌农杆菌介导将葡萄糖氧化酶基因转入水稻 总被引：28，自引：0，他引：28
摘要:将具有广谱抗病作用的葡萄糖氧化酶（glucose oxidase , GO）基因插入具有潮霉素抗性选择标记的双元载体pCAMBIA1301，新构建了水稻高效表达载体pCAG1301。将此质粒导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens ）菌株LBA4404后,转化粳稻(Oryza. sativa L.ssp.japonica )品种日本晴(Nipponbare)的幼胚，并由筛选出的潮霉素抗性愈伤组织分化再生植株。对所得潮霉素抗性水稻植株的Southern杂交分析表明，GO基因已整合到受体基因组。淀粉-碘化钾显色反应检测到了转基因植株产生的过氧化氢，证实GO基因表达产生的葡萄糖氧化酶已经在水稻中发挥功能。抗病性鉴定表明，所得转基因水稻对稻瘟菌(Magnaporthe grisea )具有良好的抗性。 相似文献
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甘露糖阳性选择系统的建立及在番茄转化中的应用 总被引：15，自引：1，他引：15
利用PCR克隆了大肠杆菌(Escherichia coli)6-磷酸甘露糖异构酶基因（pmi)并进行了序列测定。将该基因替换植物表达载体pAMBIA2301中的卡那霉素抗性基因，构建了以pmi为选择标记基因的植物表达载体pPMI，并导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中。研究了甘露糖对番茄(Lycopersicum esculentum)生长和生根的影响及叶盘对甘露糖的敏感性。通过根癌农杆菌介导对番茄进行遗传转化，获得转化番茄再生植株，并对转化植株进行了PCR扩增检测。研究表明以甘露糖阳性选择系统在番茄遗传转化中应用是可行的。 相似文献