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实验以对小麦白粉病菌免疫的小黑麦异多附加系Ｍ１７（１Ｒ″６Ｒ″） 为材料, 一组接种小麦白粉病菌,另一组不接种。分别提取两组叶片的总ＲＮＡ,分离出ｍＲＮＡ,在体外反转录合成ｃＤＮＡ,克隆进λｇｔ１０ 载体,得到了１ 个含９－８ ×１０４ 个重组子的ｃＤＮＡ 文库。两组ｃＤＮＡ 双链经切口平移法制成总ｃＤＮＡ 探针,分别与ｃＤＮＡ文库杂交,通过差别筛选的方法,找到了６ 个与小麦白粉病菌诱导有关的阳性克隆ｃＤＮＡ 克隆。将这６ 个阳性克隆用Ｈｉｎｄ Ⅲ和Ｂｇｌ Ⅱ进行双酶切分析,通过比较２ 个克隆酶切片段的差异,从１ 个克隆中找出１ 个约２－０ ｋｂ 的片段,此片段中包含约０－８６ ｋｂ 的外源ｃＤＮＡ 的片段。 相似文献
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以对小麦白粉病菌免疫的小黑麦异多附加系Ｍ１７为材料,一组接种小麦白粉病菌,另一组不接种。分别提取两组叶片的总ＲＮＡ,经磁珠法分离出ｐｏｌｙＲＮＡ,为Ｏｌｉｇｏ为引物,经反转录合成ｃＤＮＡ,将接种组双链ｃＤＮＡ克隆进入λｇｔ１０载体,得到一个含９．８×１０＾４个重组噬菌体的ｃＤＮＡ库。 相似文献
3.
叶志彪 《华中农业大学学报》1993,12(5):485-489
油梨果实在７℃下贮藏一定时期，取果实样品抽提总ＲＮＡ，通过ｏｌｉｇｏ ｄＴ纤维素柱纯化，获得ｐｏｌｙ（Ａ）＾＋ｍＲＮＡ，利用λＺａｐ－ｃＤＮＡ合成试剂盒合成双链ｃＤＮＡ，再将ｃＤＮＡ连接到克隆载体Ｕｎｉ－ＺａｐＸＲ上，构成与油梨果实成熟有关的ｃＤＮＡ文库，同时，利用纤维素酶和乙烯形成酶克隆探针，对文库作了筛选。 相似文献
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新城疫病毒F_（48）E_8株cDNA文库的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
以ＳＰＦ鸡胚繁殖我国标准新城疫病毒Ｆ＿（４８）Ｅ＿８强毒株，经蔗糖密度梯度超速离心纯化病毒。再以酚－ＳＤＳ法提取病毒基因组ＲＮＡ，作为反应模板、采用Ｐｒｏｍｅｇａ公司商品试剂盒合成双股ｃＤＮＡ。以同聚物加尾的方法将ｃＤＮＡ克隆到质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ（一）中，经ＡＩＸ平板筛选，限制性内切酶分析和Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记的核酸探针检测，共获得插入外源片段大小在０．６～４．８ｋｂ的阳性克隆７５个，初步构建了Ｆ＿（４８）Ｅ＿８株的ｃＤＮＡ文库 相似文献
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欧洲油菜花粉cDNA文库的构建 总被引：4，自引：0，他引：4
从欧洲油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）成熟花粉中提纯出ｍＲＮＡ．ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡ在ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）引导下，用反转录酶合成ｃＤ－ＮＡ第一链，用大肠杆菌ＲＮＡ酶Ｈ和大肠杆菌ＤＮＡ聚合酶Ｉ置换合成ＣＤＮＡ第二链．加上ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ接头。最后将双链ＤＮＡ克隆子λｇｔｌｌ载体中。用Ｂｃｐｌ作探针，杂交筛选构建的ｃＤＮＡ文库。 相似文献
6.
从玉米叶片中提取总ＲＮＡ后，再利用ｏｌｉｇｏ（ｄ７）－纤维素亲合层析往，从中分离出ｍＲＮＡ，然后以ｏｌｉｇｏ（ｄ７）－ＸｂａＩａｄａｐｔｏｒ作为引物，ｍＲＮＡ作为模板，合成相应的ｃＤＮＡ．并定向克隆进λＧＥＭ－４载体，构建出滴度为２×１０５ｐｆｕ的玉米叶片ＣＤＮＡ文库、最后，利用寡核苷酸探针，从ｃＤＮＡ文库中筛选到８个阳性克隆。 相似文献
7.
本研究改进了用ＰＣＲ合成ｃＤＮＡ的方法。先用具有长链合成能力的高效反转录酶合成第一链ｃＤＮＡ,用多种ＲＮＡ酶去除ＲＮＡ后,在第一链ｃＤＮＡ３’端用末商转移酶特异性加上多个ｄＧＴＰ,再用具高保真和长链合成能力的耐高温ＤＮＡ聚合酶ＰＣＲ扩增总ｃＤＮＡ。总ｃＤＮＡ长度分析试验结果表明本法合成的总ｃＤＮＡ质量高。 相似文献
8.
鸡白细胞介素-2 cDNA克隆 总被引：7，自引：1，他引：7
用哺乳动物细胞表达克隆系统克隆了鸡ＩＬ－２ｃＤＮＡ。以ＣｏｎＡ（２０μｇ／ｍＬ）诱导ＳＰＦ鸡脾脏淋巴细胞,第２０小时收集细胞,提取ｍＲＮＡ,以ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔｅｍｆｏｒｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ试剂盒合成ｃＤＮＡ,定向连结于穿梭质粒ｐＳＶ·ＳｐｏｒｔⅠ,构建ｃＤＮＡ文库。将文库分组提取重组质粒,转染ＣＯＳ－７细胞,表达ｃＤＮＡｓ。以淋巴细胞增殖试验检测表达产物ＩＬ－２活性。经过３轮筛选,获得１４个具有ＩＬ－２活性的克隆。选择其中４个进行酶切分析,结果显示这４个ｃＤＮＡ大小分别为１．５,１．０,０．８和０．８ｋｂ。 相似文献
9.
牛生长激素cDNA的克隆与序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
从平脑垂体中分离总ＲＮＡ，经ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）一纤维素柱纯化ｍＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ，经ＰＣＲ技术扩增牛生长激素（ｂＧＨ）ｃＤＮＡ序列，长度为６２０ｈｐ，将ＰＣＲ产物克隆于ｐＵＣ１９Ｓｍａｌ位Ⅰ点转化大肠杆菌ＤＨ５α，经蓝白斑筛选，获得重组克隆，分离重组质粒，经限制性内切酶酶切分析后，进行序列分析。结果表明，一质粒中所含克隆片段为ｂＧＨｃＤＮＡ全序列，与国外所发表的ｂＧＨ核旮酸序列基本相同 相似文献
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本文以鸡外周血单个核细胞总ＲＮＡ为模板,据已报道的８种哺乳动物ＩＬ－１β核酸序列保守区设计合成１对引物,反转录合成ｃＤＮＡ链,经ＰＣＲ扩增,回收扩增后ＤＮＡ片段,用ｋｌｅｏｎｏｗ酶处理,与Ｐ＾ｕｃ１９／ＳｍａＩ连接构成重组质粒,转化宿主菌大肠杆菌ＪＭ１０９,筛选出含有插入片段的重组质粒,用ＰＣＲ及酶切分析鉴定,结果表明获得了带有鸡了ＩＬ－１β片段的ｃＤＮＡ克隆,再经序列分析测定,得知此片段长为２７ 相似文献
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根据已报道的烟草花叶病毒移动蛋白基因序列,设计合成一对特异性引物。以广东ＴＭＶ株系ＲＮＡ为模板,用ＡＭＶ反转录酶反转录合成ｃＤＮＡ第一链;在复性温度５１℃条件下进行ＰＣＲ扩增,获得了一条０．８Ｋｂ的特异扩增产物,与已发表的ＴＭＶＭＰ基因编码区８０３ｂｐ大小相近;并将之克隆于ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ（＋）质粒。限制性内切酶酶切分析表明,本研究筛选到的是含ＴＭＶＭＰｃＤＮＡ的正向插入组质粒。 相似文献
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大赖草和新麦草物种专化DNA重复序列研究：Ⅰ.分离和鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
从本研究建立的Ｌｅｙｍｕｓ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ（Ｌａｍ．）Ｔｚｖｅｌｅｖ（大赖草）和Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ ｊｕｎｃｅａ（Ｆｉｓｃｈ）Ｎｅｖｓｋｉ（新麦草）的ＤＮＡ文库分别挑出５５０和３４８个重组克隆提取质粒ＤＮＡ,用普通小麦。Ｌ．ｒａｃｅｍｏｓｕｓ和Ｐｓａ．ｊｕｎｃｅａ等物种的总ＤＮＡ作探针,通过两轮点渍杂交,发现有１５个克隆稳定地与Ｌ．ｒａｃｅｍｏｓｕｓ或（或）Ｐｓａ．ｊｕｎｃｅａ有强 相似文献
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新城疫病毒F48E8株cDNA文库的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
以ＳＰＦ鸡胚繁殖我国标准新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８强毒株，经蔗糖密度梯度超速离心纯化病毒。再以酚－ＳＤＳ法提取病毒基因组ＲＮＡ，作为反就模板，采用Ｐｒｏｍｅｇａ公司商品试剂合成双股ｃＤＮＡ。以同聚物加尾的方法将ｃＤＮＡ克隆 粒ｐＧＥＭ ３Ｚｆ中，经ＡＩＸ平板筛选，限制性内切酶分析和Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记的核酸探针检测，共获得插入外源片段大小在０．６－４．８ｋｂ的阳性克隆７５个，初步构建了Ｆ４８Ｅ８株 相似文献
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从本研究建立的Ｌｅｙｍｕｓｒａｃｅｍｏｓｕｓ（Ｌａｍ．）Ｔｚｖｅｌｅｖ（大赖草）和Ｐｓａｔｈｙ－ｒｏｓｔａｃｈｙｓｊｕｎｃｅａ（Ｆｉｓｃｈ）Ｎｅｖｓｋｉ（新麦草）的ＤＮＡ文库中分别挑出５５０和３４８个重组克隆提取质粒ＤＮＡ,用普通小麦、Ｌ．ｒａｃｅｍｏｓｕｓ和Ｐｓａ．ｊｕｎｃｅａ等物种的总ＤＮＡ作探针,通过两轮点渍杂交,发现有１５个克隆稳定地与Ｌ．ｒａｃｅｍｏｓｕｓ和（或）Ｐｓａ．ｊｕｎｃｅａ有强杂交信号,与中国春无或基本无杂交信号,初步认定这些克隆为物种专化ＤＮＡ重复序列克隆。其中５个又被选取作交互杂交以测定彼此间的同源性,结果表明,ｐＰｊ６０５与ｐＰｊ２０５有同源性,而ｐＬｒ３４４,ｐＬｒ４２６和ｐＬｒ６４７相互间以及与ｐＰｊ２０５和ｐＰｊ６０５之间均无序列同源性。 相似文献
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采用“富集ＰＣＲ”方法,用单个特异引物和ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５从桃伤处理叶片ｃＤＮＡ 中扩增出特异性片段⒚将扩增产物分离并克隆筛选到１３ 个重组克隆,其中有６ 个克隆能与ＡＣＣ氧化酶基因组ＤＮＡ 杂交,对其中一个阳性克隆ｐＧＥＭＡＣ１２ 作酶切分析,发现其酶切图谱与已报道的桃果实成熟相关的ＡＣＣ氧化酶ｃＤＮＡ 基本一致⒚ＤＮＡ 序列分析表明,插入片段两端ＤＮＡ 序列均是 ５＇端特异引物序列,表明是由５＇端特异引物单个引物扩增出来,全序列分析表明插入片段全长８３３ ｂｐ,是ＡＣＣ 氧化酶ｃＤＮＡ 基因编码区的一部分,５＇端缺少启始密码子ＡＴＧ,３＇端缺少部分编码序列和终止密码子ＴＡＡ⒚ 相似文献
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将人尿激酶原（Ｐｒｏ－ＵＫ）基因ｃＤＮＡ分别插入到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子和ｐＳＶ２－ｎｅｏ的ＳＶ４０启动子下游,构建了重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ,分别将这两种表达质粒以脂质体载体法转染ＢＨＫ２１细胞。ＥＬＩＳＡ检测结果表明,ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ在哺乳动物细胞中能够表达,７２ｈ表达量分别为２８．７ｎｇ／ｍｌ和１３．５ｎｇ／ｍｌ。 相似文献
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以“秦美”猕猴桃果实呼吸跃变初期ｃＤＮＡ第一链为模板，参考大麦钙调蛋白基因序列合成５′端和３′端引物，利用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）合成了完整的猕猴桃钙调蛋白ｃＤＮＡ，克隆并测定了其全序列。结果表明，猕猴桃钙调蛋白基因读码框架内序列由４４４个核苷酸组成，共编码１４８个氨基酸，且与植物领域里发表的大麦及苜蓿的钙调蛋白基因有很高的同源性。在核苷酸序列上与大麦有８６．１６％的同源性，与苜蓿有８５．６９％的同源性，其编码的氨基酸与大麦和苜蓿的不同分别只是一个氨基酸的差异，同源率高达９９．３％． 相似文献