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固醇调节元件结合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2,SREBP2）属于碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子家族,在胆固醇的代谢过程中具有重要的调控作用。克隆秦川牛（Bos taurus）的SREBP2基因并构建相应腺病毒过表达载体,包装扩繁获得高滴度腺病毒,对于在细胞水平上研究SREBP2基因的功能和作用机制具有重要作用。本研究以秦川牛脂肪组织为实验材料,提取总RNA并反转录为cDNA,依据GenBank收录的牛的SREBP2基因（Accession No.NM001205600）mRNA序列设计引物,克隆出SREBP2基因编码区（coding sequence,CDS）全长。将SREBP2基因与穿梭载体连接构建pAdTrack-CMV-SREBP2表达载体,用PmeⅠ分别酶切线性化pAdTrack-CMV-SREBP2和空白对照pAdTrack-CMV载体并转化含有骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌（Escherichia coli）BJ5183感受态进行同源重组,得到腺病毒重组载体pAd-SREBP2和pAd-CMV,分别用PacⅠ酶切后胶回收DNA大片段,并将回收产物转染293A细胞包装得到腺病毒Ad-SREBP2和Ad-CMV,增殖并提高病毒滴度,得到高滴度病毒后,用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记法测定显示Ad-SREBP2和Ad-CMV的病毒滴度分别为7×108和1.3×109GFU/mL。将Ad-SREBP2和Ad-CMV腺病毒侵染秦川牛前体脂肪细胞检测病毒的有效性,实时定量PCR检测结果显示,侵染48h时SREBP2基因的表达量提高了102.3倍。本研究成功克隆了秦川牛的SREBP2基因,构建了病毒重组体,包装增殖获得了高滴度病毒,为在细胞水平上基因功能的研究提供了基础资料。 相似文献
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山羊c-Myc原癌基因克隆、原核表达和GST-Myc融合蛋白纯化 总被引：2，自引：0，他引：2
本研究的目的是通过分子克隆、原核表达和蛋白纯化技术获得山羊GST-Sox2融合蛋白.用RT-PCR方法从山羊(Capra hircus)肠组织克隆了c-Myc基因,通过TA克隆,构建了pMD18-T-Myc质粒.DNA测序证明,山羊c-Myc全长cDNA约1320 bp,该序列包含一个完整的开放阅读框,编码439个氨基酸,经分析该序列与绵羊(Ovis aries)的c-Myc序列同源性为99.2%.将该cDNA片段亚克隆至pGEX-KG载体,构建了重组质粒pGEX-KG-Myc.经酶切鉴定和测序,将重组质粒导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,由IPTG诱导表达,以谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和纯化GST-Myc融合蛋白.SDS-PAGE分析表明,纯化的GST-Myc融合蛋白约75 kD,与预期值相符,且呈现清晰的单一条带.Western blot检测证实,该融合蛋白能够被GST抗体所识别.本实验克隆了山羊c-Myc基因,获得了高纯度的GST-Myc融合蛋白,为其多克隆或单克隆抗体的制备提供了基础资料,为山羊iPS细胞(induced pluripotent stem cells)检测创造了条件. 相似文献
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慢病毒介导法是最有前途的转基因动物生产方法之一,高滴度慢病毒颗粒的包装是慢病毒转基因动物技术的关键。本研究应用含有增强型绿色荧光蛋白基因（eGFP）的第3代慢病毒载体系统,用脂质体转染法将慢病毒系统4质粒共转染293T包装细胞,培养48-72h收集病毒上清液,通过超速离心进行浓缩,采用批量快速测定法（LaSRT）定病毒滴度。结果显示,用脂质体转染法包装的慢病毒能成功地感染293T细胞,经检测病毒滴度达到5×10^8IU／mL以上,初步建成了高滴度慢病毒包装平台,为慢病毒介导制作转基因动物奠定了良好的研究基础。 相似文献
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小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)是小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)的病原。Nectin-4为PPRV感染宿主上皮细胞的受体。本研究采用合成的Nectin-4基因,构建重组质粒pLOV-eGFP-Nectin-4。将该重组质粒与包装质粒pSPAX2和外膜质粒pMD2.G质粒共转染293T细胞,获得逆转录病毒样颗粒。为了构建稳定表达PPRV受体Nectin-4的MDBK (Madin-Darby bovine kidney)细胞系,将含有逆转录病毒样颗粒的细胞培养上清液感染MDBK细胞,利用嘌呤霉素筛选、纯化,获得了稳定表达Nectin-4蛋白的MDBK细胞,将其命名为MDBK-Nectin-4。pLOV-eGFP-Nectin-4、p SPAX2和pMD2.G三质粒共转染293T细胞后荧光结果表明,慢病毒成功包装。嘌呤霉素对MDBK细胞最小致死浓度检测结果表明,1μg/mL的嘌呤霉素为最佳的筛选工作浓度。RT-PCR检测结果表明,Nectin-4基因能够在MDBK-Nectin-4细胞中转录成mRNA。Western blot检测结果表明,Nectin-4在MDBK-Nectin-4细胞中能够稳定表达。间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay, IFA)结果表明,表达的Nectin-4蛋白主要分布在细胞膜上。构建的MDBK-Nectin-4细胞系在连续传代至20代,仍然能够稳定表达Nectin-4蛋白,结果表明具有良好的遗传稳定性。PPRV分别感染MDBK细胞与MDBK-Nectin-4细胞系,后者较于前者能够更快地出现细胞病变。该细胞系的建立为深入研究PPRV与受体Nectin-4的相互作用机制,以及临床快速地分离PPRV提供了实验材料。 相似文献
5.
为建立表达标记基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作平台,本研究在PRRSV HuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上,采用突变PCR技术将新城疫病毒(NDV)NP蛋白末端优势抗原区插入PRRSV NSP2蛋白的复制非必须区,经基因片段的克隆、拼接,构建了含有外源标记基因的感染性的PRRSV cDNA克隆psk-HuN4-F112-Δ52+NP49。用限制性内切酶SwaΙ将psk-HuN4-F112-Δ52+NP49线性化后通过细胞外转录获得病毒RNA,用脂质体法将病毒RNA转染叙利亚仓鼠肾细胞(BHK-21)包装出病毒粒子,再转接到猴胚胎肾上皮细胞(MACR-145)传代拯救病毒。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定。结果表明,拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记(病毒基因组14667位人工产生的MluⅠ酶切位点)和插入的标记基因序列。间接免疫荧光试验表明,外源基因NP49在拯救的PRRSV中表达,且能够在PRRSV传代过程中稳定遗传。病毒生长特性比较显示,拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性。本研究构建了含有标记基因PRRSV的感染性克隆并获得了拯救病毒,为进一步开发新型PRRS疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。 相似文献
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黑曲霉木聚糖酶基因（xynB）的克隆及真核分泌表达 总被引：2，自引：0，他引：2
通过RT-PCR方法,以黑曲霉(Aspergillus niger)GIM3.452总RNA为模板,克隆出木聚糖酶B(xy-lanase B,xynB)基因的成熟肽编码序列(567 bp),编码188个氨基酸.将其与猪腮腺分泌蛋白(parotid secretoryprotein,PSP)基因的信号肽序列通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)得到拼接片段PSxynB,并将其克隆到真核表达载体pcDNA6/HisTMA中,得到重组质粒pcDNA-PSxynB,重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且构建正确.在脂质体介导下将重组质粒pcDNA-PSxynB转染猪肾细胞(PK15),通过RT-PCR证实其在PK15细胞中表达,并在细胞培养液中测到了木聚糖酶活最高达36.4 IU/mL. 相似文献
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本研究通过PCR方法从小鼠(Mus musculus)基因组中扩增出Oct4启动子的CR4区和CR1区,将其克隆到真核报告载体pEGFP-1,构建了携带Dct4启动子片段的小鼠生殖细胞特异性报告载体CR1,4-pEGFP-1.用该载体转染多种细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(EGFP)在细胞中的表达情况,同时以半定量RT-PCR检测转染细胞中Oct4及其它生殖细胞特异性基因的转录情况.结果显示,GFP在小鼠胚胎干细胞、小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和C2C12细胞中均不表达,而在P19细胞和睾丸细胞中表达.RT-PCR结果显示,Oct4在P19、睾丸细胞和生殖干细胞中特异性转录.这表明所构建的绿色荧光蛋白报告载体只在生殖细胞和多能生殖干细胞中内表达,该质粒可作为示踪生殖细胞的工具,同时也可以作为生殖干细胞多能性状态的一个监测标记. 相似文献
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通过Overlap-PCR方法克隆了秦川牛(Bos tarus)的增食欲素受体1(HCRTR1)基因编码区全长,获得1 278 bp编码区全长序列(GenBank登录号:DQ874350),将其克隆至pMD-18T载体上,经测序表明获得的cDNA序列与GenBank公布的序列同源性均为98%.阳性质粒经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后,将目的片段定向克隆到pET32a( )表达载体上,转化B121(DE3)感受态大肠杆菌(Escherichia coli),经鉴定正确后,用IPTG诱导目的蛋白的表达.SDS-PAGE表明,秦川牛HCRTR1基因在大肠杆菌中没有表达,进一步生物信息学分析表明,HCRTR1基因的表达产物为具有7个跨膜螺旋的G蛋白偶联受体,复杂的蛋白质结构使得其不能在原核表达系统中获得表达. 相似文献
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王群 《农业生物技术学报》2007,15(5)
应用PCR技术从含有猪resistin基因cDNA的质粒RSTN-T中扩增目的基因片段，将其克隆至pcDNA3.1(+)表达载体中，经酶切及测序鉴定后，采用LipofectaminTM 2000 转染Hela细胞，用G418筛选稳定表达的Hela细胞株。以RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE、Western blot分析其表达情况。测序结果表明成功构建了真核表达载体pcDNA3.1－RSTN，经G418筛选获得了Hela细胞克隆。用RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE、western blot技术检测到了RSTN在Hela细胞中的转录与表达。重组质粒pcDNA3.1－RSTN的成功构建和表达为进一步研究猪resistin 的DNA疫苗奠定了基础。 相似文献
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本研究克隆了广西沼泽型水牛γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)基因,并构建了水牛IFN-γ原核表达质粒。从健康沼泽型水牛静脉无菌采血,分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),用刀豆素A(Concanavalin A,ConA)诱导培养13 h后,提取细胞总RNA,用水牛IFN-γ基因特异性引物通过RT-PCR扩增水牛IFN-γ成熟肽编码区cDNA序列,将其克隆到pMD18-T载体中。RT-PCR产物电泳可见约457 bp大小目的片段。经过限制性酶切分析,测序证实克隆得到的基因序列正确。将IFN-γ成熟肽编码区基因片段切下亚克隆到表达载体pET-32a 中,构建成重组表达质粒pET-mIFN-γ。PCR、双酶切电泳和序列测定结果均证实已插入约457 bp的IFN-γ基因片段。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,水牛IFN-γ基因在大肠杆菌中获得了高效的表达,融合蛋白的分子量为35 ku,表达量占菌体总蛋白的43.6%。 相似文献
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Suyundukov Ya. T. Suyundukova M. B. Bezuglova O. S. Khabirov I. K. Khasanova R. F. Semenova I. N. Rafikova Yu. S. Ilbulova G. R. 《Eurasian Soil Science》2022,55(1):27-35
Eurasian Soil Science - The results of the study of the properties of urban soils of the city of Sibay located in the mining region of the Republic of Bashkortostan are presented. A specific... 相似文献
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物联网是一个集信息通信、数据交换、传感器技术与软件工程于一体的综合性产业,探讨和分析了物联网的结构体系与发展中遇到的安全问题。 相似文献
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荔枝种子从果实中剥离出来后, 即使在室内条件下, 也极易失水干缩, 潮湿环境中又易发霉而腐烂。扫描电镜观察表明: 种皮上布满纹孔, 水分散失面积很大; 种脐部为疏松的海绵组织, 且营养丰富。据此, 生产上应对种子彻底清洗, 并保存于适当湿度的环境中, 以提高其发芽率。 相似文献
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三门峡水库库岸坍塌成因分析与防治措施研究 总被引：10，自引：0，他引：10
三门峡水库自1960年9月蓄水运行以来,库岸坍塌现象频繁发生,平均每年塌岸0.5～0.7亿m3.指出了造成库岸坍塌的原因主要是地质环境的影响以及水力条件的变化;不同的地形、地貌、地质结构和岩性特征,表现了不同的塌岸强度,其中黄土塬区为极强塌岸段,黄河Ⅱ级阶地为强烈塌岸段,黄河Ⅰ级阶地为中等强烈塌岸段;分析了引起库岸坍塌的主要水力条件有大气降水、地表水和地下水,并且不同水力条件及其变化特征,对库岸坍塌影响的方式和程度也不同;最后给出了防治库岸坍塌应采用标本兼治的原则,治标是指对塌岸进行必要的加固、支挡、衬砌等;治本就是根据引起塌岸的原因以及不同地质环境条件下的塌岸特征和水力条件,因地制宜,因害设防,从根本上进行综合治理. 相似文献
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Kholodov V. A. Farkhodov Y. R. Yaroslavtseva N. V. Ziganshina A. R. Maksimovich S. V. 《Eurasian Soil Science》2022,55(7):998-1004
Eurasian Soil Science - Layers were step-by-step removed from macroaggregates (2–1 mm in diameter) of Protocalcic Chernozems via successive abrasion in a revolving rotator during 5, 10, 15,... 相似文献
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Unity of mechanisms of water and wind erosion of soils 总被引：1，自引：0，他引：1
An equation for the threshold velocity of the water or wind flow at which erosion of a homogeneous model soil begins was derived on the basis of accepted and explicitly formulated suppositions and limitations and tested using experimental data. The validity of the proposed mechanisms and equations describing the lifting force of the soil-eroding water or wind flow and the interaggregate cohesion in a model homogeneous incoherent soil was confirmed. The limit for the decrease in the threshold flow velocity with decreasing size of the soil particles (aggregates) was theoretically substantiated. The first unified equation of the threshold velocity of the water or wind flow for a homogeneous model soil in dimensionless variables was derived and experimentally justified. 相似文献
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大豆连作障碍的研究进展 总被引：17，自引：0，他引：17
从生物学、微生物学和植物营养生理学的角度及诸多障碍因子等方面,综合评述和分析了国内外大豆连作研究的现状,阐述了目前国内外学者提出的各种应对连作问题的策略和技术措施,提出大豆连作障碍研究仍有待解决的问题和研究方向。 相似文献