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[目的]为探索一种适于连接PCR产物和不同粘端的新方法。[方法]分别采用冻融法、割胶法、试剂盒法和牙签法连接PCR产物与质粒DNA以及酶切产物与质粒DNA,比较不同连接方法对重组效率的影响。[结果]采用冻融法和割胶法连接PCR产物与pMD18-T,其连接效率分别为94.00%和93.00%,略高于试剂盒法和牙签法。采用冻融法和割胶法连接酶切产物的重组效率分别为86.67%和88.00%,略高于试剂盒法和牙签法。牙签法简化了连接前DNA相关操作,具有较高的连接效率,完全能够满足普通连接反应,特别是粘端连接反应要求。[结论]割胶法具有很高的重组效率和转化效率,可以满足普通连接反应、文库构建对连接效率和转化效率的要求,具有一定的应用前景。 相似文献
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胡萝卜抗冻蛋白基因克隆及植物表达载体构建 总被引：20，自引：0，他引：20
以胡萝卜品种 Autumn King的幼苗为材料 ,用 CTAB法提取其基因组 DNA,以 PCR ( Polym eraseChain Reaction)的方法在体外扩增出胡萝卜抗冻蛋白基因 ( afp) ,以 p UCm - T Vector为载体构建成胡萝卜 afp的克隆载体 p TAF,用 Eco R 消化重组质粒 p TAF使其线性化 ,再用 DNA聚合酶 Klenow大片段补平末端 ,然后用Xba 消化 ,获得一末端粘 ,一末端平的目的片段 ( afp)。植物表达载体 p BI12 1用 X ba 和 Sma 双酶切 ,获得一末端粘 ,一末端平的线性质粒。将目的片段与线性质粒在 T4DNA连接酶的作用下进行定向连接 ,构建成胡萝卜 afp的植物表达载体 p BAF 相似文献
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胡萝卜抗冻蛋白基因克隆及植物表达载体构建 总被引：4，自引：1，他引：4
以胡萝卜品种Autumn King的幼苗为材料，用CTAB法提取其基因组DNA，以PCR（Polymerase Chain Reaction)的方法在体外扩增出胡萝卜抗冻蛋白基因（afp),以pUCm-T Vector为载体构建成胡萝卜afp的克隆载体pTAF，用EcoRⅠ消化重组质粒pTAF使其线性化，再用DNA聚合酶Ⅰ Klenow大片段补平末端，然后用XbaⅠ消化，获得一末端粘，一末端平的目的片段（afp)。植物表达载体pBI121用XbaⅠ和SmaⅠ双酶切，获得一末端粘，一末端平的线性质粒。将目的片段与线性质粒在T4DNA连接酶的作用下进行定向连接，构建成胡萝卜afp的植物表达载体pBAF。 相似文献
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【目的】构建方便快捷的植物表达载体.【方法】应用Isothermal in vitro recombination system or"Gibson Assembly"方法设计包含片段间20~25 bp互补重叠序列的引物,通过PCR扩增出带有首尾重叠的目的 DNA片段,可将1个或多个片段和线性化的载体一步组装成表达载体.【结果和结论】利用该方法快速构建了多个水稻基因的全长以及部分缺失编码区表达载体.此外,还通过对Gibson Assembly连接产物进行PCR扩增后再连接到载体,提高多DNA片段组装的效率.本方法不受目的片段内部限制性酶切位点的限制,可广泛应用于各种载体的构建. 相似文献
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为筛选遗传背景清晰、裂解性能优良、宿主识别谱广泛的噬菌体用于抗菌产品开发,满足畜禽减抗、无抗养殖需求,通过易错PCR技术定向改变T7噬菌体尾丝蛋白羧基末端基因序列,并构建T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库,为筛选识别不同宿主的T7噬菌体奠定基础。提取T7噬菌体基因组,用SfiⅠ进行单酶切,回收SfiⅠ位点左侧基因组。常规PCR扩增尾丝蛋白羧基末端基因序列(TF-ct,约350 bp)以及gene17至T7基因组右侧末端基因序列(约4 000 bp)。以回收的TF-ct片段为模板,进行易错PCR扩增,将随机突变的TF-ct基因片段连接T载体,构建质粒文库。从质粒文库中用SfiⅠ/SphⅠ双酶切出TF-ct片段,并与SfiⅠ位点左侧基因组片段、gp17右侧基因组片段进行连接,利用包装蛋白拯救出T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库。结果易错PCR成功扩增TF-ct基因片段,并连接T载体构建质粒文库;同时随机突变的基因正确插入T7噬菌体基因组相应位置,成功拯救出尾丝蛋白定向进化T7噬菌体文库。从噬菌体文库中随机挑选15个克隆进行序列分析,目的基因的突变率在1.23%～2.16%;尾丝蛋白loop区域的氨... 相似文献
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[目的]为了构建新孢子虫NcGRA2基因的真核表达载体,探讨重组载体在体外细胞的表达.[方法]从含有NcGRA2基因的重组质粒pGEX-4T1-NcGRA2中,用限制性内切酶进行酶切获得带有粘性末端的NcGRA2基因片段.经琼脂糖凝胶电泳切胶回收NcGRA2基因片段,与pcDNA3.1载体连接.将构建的真核表达质粒pcDNA3.1-NcGRA2转染到293细胞中表达.[结果]经酶切分析和序列测定,证实了重组质粒的正确连接.经免疫荧光抗体试验验证pcDNA3.1-NcGRA2能在293细胞中表达NcGRA2蛋白.[结论]获得重组质粒pcDNA3.1-NcGRA2,并能在体外细胞中表达NcGRA2蛋白,为进一步研究核酸疫苗的动物免疫试验奠定了基础. 相似文献
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为克隆artemin基因上游调控序列,探明该基因表达的调控机理,分别用4种不同的具有平末端的限制性内切酶消化卤虫基因组DNA,然后与DNA接头连接,构建成无载体连接的卤虫Genome Walker DNA文库．利用基因组步行法,经2轮TD—PCR扩增出长度约750bp的artemin基因上游调控序列片段,扩增产物测序后得到2个长度分别为209bp和210bp的序列．序列分析表明：在3’—末端片段中,存在转录起始位点“TTATTT”,TATA框位于-32～-38,CAAT框则位于-75～-78．此外,在这两个片段中还存在一些潜在的TFIIB识别元件,GC盒,AT富含元件,这些元件对于该基因的转录具有一些潜在的调控作用． 相似文献
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采用体外连接法构建了含有A型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A和3C或3ABC基因的重组腺病毒表达载体.利用PCR技术分别扩增得到P1-2A、3C和3ABC基因,经XbaⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/KpnⅠ双酶切之后,与XbaⅠ/KpnⅠ双酶切的穿梭载体pShuttle2大片段连接,获得重组穿梭质粒pSh-P12a3c和pSh-P12a3abc.然后用I-CeuⅠ和PI-SceⅠ双酶切穿梭质粒回收目的基因表达盒,通过体外连接法将目的基因表达盒与BD Adeno-X Vi-rus DNA连接,转化DH5α感受态菌.获得两个重组腺病毒质粒分别命名为A-P12a3c和A-P12a3abc,经PCR、酶切及测序鉴定正确.用PacⅠ酶切后转染HEK293细胞,取转染细胞裂解液上清连续传至第5代时,在24~48 h内细胞完全病变.分别提取第3、7代病毒DNA,可扩增出目的基因,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且能稳定传代. 相似文献
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抑制消减杂交( SSH)高灵敏、易操作、高效富集低表达丰度基因和均一化目的基因片断,广泛用于差异表达基因的分离和cDNA文库构建.在实验操作中常出现低表达mRNA和cDNA丢失、大片断连接效率低等问题,构建的文库质量差,文章通过改进萃取操作提高目的产物(mRNA和cDNA)回收率,回收率增加30％以上;通过采用PVPP、高浓度KAc专一性结合和LiC1沉淀等措施除去RNA中的多酚和多糖、进而增加可分离mRNA种类和含量,对应的Uni-EST种类增加近3倍,通过采用胶回收并分段连接保护大片断cDNA等措施使文库中转录本丰富度增加,大片段(500 bp以上)比例增大,cDNA平均长度增大,文库质量明显提高. 相似文献
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本文报道了胰岛素A,B链基因,人表皮生长因子基因和人α心钠素基因的人工合成。人工合成是在DNA合成仪上完成的,先合成上述基因的平均为60个核苷酸的各寡核苷酸片段,经过对各片段的纯化、磷酸化和连接,得到上述多肽基因。并进行了电泳检测。人工基因合成的重要意义在于可以正确地、高效地合成基因工程所需的基因,是获得在原核生物中表达的多肽基因的主要途径,并可将重组DNA和表达所需的碱基顺序同时组合在合成的基因中。人工基因合成有广泛的应用前途和价值。 相似文献
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Reversible cleavage and ligation of hepatitis delta virus RNA 总被引：18，自引：0，他引：18
A 148-nucleotide subfragment of hepatitis delta virus RNA was shown to undergo cleavage and ligation reversibly. The direction of the reaction is determined by the presence or absence of Mg2+ ions, with the presence of Mg2+ favoring the cleavage reaction. Ligation requires specific conformation of the RNA molecules involved and occurs only between two cleaved RNA fragments that are still held together by hydrogen bonds. The ligation reaction occurs rapidly on removal of Mg2+ by EDTA. This represents a new class of RNA enzymes. 相似文献
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该文以生态经济的视角,运用数据包络分析法——DEA对农业资源配置效率进行研究。在构建指标体系时注重经济效益和生态影响的综合体现,并以此为原则选择3个产出指标和7个投入指标对河南省18市的农业资源配置效率进行实证分析,测算出各地市的纯技术效率和规模效率,并运用DEA对效率较低市的农业资源配置进行优化。结果表明:河南省农业资源配置总体效率较高,但仍存在地区差异,部分地市的农业资源投入均不同程度出现冗余,其中化肥、农药和农膜使用量过剩现象较突出。同时,通过DEA分析工具可以根据不同地市的具体情况针对性地选择优化方案,从纯技术效率或规模效率入手优化资源配置,实现生态和经济的协调和可持续发展。 相似文献
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【目的】甜瓜细菌性叶斑病是危害甜瓜的重要种传细菌病害,是由丁香假单胞杆菌流泪病致病变种甜瓜菌株(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)引起的。论文旨在建立高效、快捷、操作简单的检测技术以防止此病原菌传播。【方法】以Gen Bank公布的甜瓜细菌性叶斑病菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因序列为靶标,设计甜瓜细菌性叶斑病菌特异性锁式探针,建立锁式探针与斑点杂交技术结合的检测体系。以保存的目的菌株为材料,提取DNA作为模板进行锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应,并将锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应的反应温度和反应时间分别进行优化。利用优化的锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应分别对健康的甜瓜种子、带有甜瓜细菌性叶斑病的甜瓜种子、无菌水及25株其他参试菌株进行检测,测定该体系的特异性。将甜瓜细菌性叶斑病菌的DNA按10倍梯度稀释,依次稀释为1 ng·μL~(-1)、100 pg·μL~(-1)、10 pg·μL~(-1)、1 pg·μL~(-1)、100 fg·μL~(-1)、10 fg·μL~(-1)和1 fg·μL~(-1)作为模板,利用优化的锁式探针连接反应、酶切反应和扩增反应,测定灵敏度。将探针与斑点杂交技术结合建立高通量检测体系,将上述反应过程中的扩增产物固定于尼龙膜上,将锁式探针上Zipcode序列的反向互补序列合成c Zipcode(检测探针),检测探针(c Zipcode)用地高辛标记后与产物进行杂交。锁式探针结合斑点杂交技术分别进行特异性检测和灵敏度测定。探针与斑点杂交技术结合建立的高通量检测体系进行人工模拟种子带菌检测,进一步验证该体系的可靠性。利用建立的高通量检测方法对205份市售疑似带病的甜瓜种子进行检测。【结果】锁式探针特异性测定结果表明,26株甜瓜细菌性叶斑病菌均能得到一条105 bp的特异性条带,而剩余25株参试菌株及无菌水均无扩增产物产生。灵敏度测定结果表明,当目的菌株的浓度稀释为1 pg·μL~(-1)时均能检测到一条105 bp的特异性条带,所以探针的检测灵敏度为1 pg·μL~(-1)。探针与斑点杂交技术结合建立的检测甜瓜细菌性叶斑病菌高通量体系能将甜瓜细菌性叶斑病与所有的参试菌种区分开,26株甜瓜细菌性叶斑病菌杂交后出现了显色反应,而25株参试菌株及无菌水均没有发生显色。锁式探针结合斑点杂交的灵敏度检测同样达到1 pg·μL~(-1)。将锁式探针结合斑点杂交进行人工模拟种子带菌检测,能将1粒带菌种子从1 000粒健康的种子检测出来,模拟种子带菌检测率都能达到0.1%(1/1 000)。从205份市售甜瓜种子中成功检测到7份市售种子带菌。将带菌种子分别加入一定量的无菌水浸泡4 h,提取悬液DNA,将悬液DNA进行PCR扩增后测序,NCBI比对后确定为甜瓜细菌性叶斑病菌。【结论】基于锁式探针结合斑点杂交技术的检测体系能够快速、准确地识别甜瓜细菌性叶斑病。 相似文献
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枣选择性扩增微卫星体系的建立及优化 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】建立和优化枣的选择性扩增微卫星（SAM）技术体系,丰富枣群体遗传学研究的方法,同时为枣利用SAM法开发SSR引物提供技术参考和模板。【方法】以冬枣、大荔龙枣和金丝小枣为试材,采用CTAB法提取样品DNA,对SAM试验过程中的酶切-连接、抑制性扩增、预扩增、选择性扩增等关键因子进行研究。【结果】利用PstⅠ和MseⅠ双酶切系统,分步法进行酶切-连接是后续试验成功的关键,抑制性扩增（20.0μL体系）模板取酶切连接液2.0μL,预扩增和选择性扩增（20.0μL体系）的模板分别取上步扩增的稀释产物各2.0μL;抑制性扩增和预扩增反应中,ExTaq取0.5 U,反应25个循环,产物稀释20倍进行下一步扩增;选择性扩增采用前6个循环中退火温度梯度降低（每循环降低1℃）的反应程序,体系中可将ExTaq用量增加到1.0 U以保证酶的保真效果。【结论】试验利用优化后的反应体系,选用16个MseⅠadapter+NN primer和SSR primer（PCT6）组成引物对进行筛选,获得了谱带清晰、分辨率高、多态性丰富的电泳图谱。该研究结果为利用SAM技术开展枣的亲缘演化、遗传多样性分析及SSR引物开发等方面的研究打下了基础。 相似文献
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Life originated, according to the RNA World hypothesis, from self-replicating ribozymes that catalyzed ligation of RNA fragments. We have solved the 2.6 angstrom crystal structure of a ligase ribozyme that catalyzes regiospecific formation of a 5' to 3' phosphodiester bond between the 5'-triphosphate and the 3'-hydroxyl termini of two RNA fragments. Invariant residues form tertiary contacts that stabilize a flexible stem of the ribozyme at the ligation site, where an essential magnesium ion coordinates three phosphates. The structure of the active site permits us to suggest how transition-state stabilization and a general base may catalyze the ligation reaction required for prebiotic RNA assembly. 相似文献
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根据正交试验设计的原理,设计了探索性正交试验和细调性正交试验来确定沙打旺ISSR-PCR体系中各成分的浓度。得到既稳定又能扩出最多条带的适合沙打旺的ISSR-PCR最佳反应体系,即20μl的反应体系中含有1×buffer,dNTP 0.2 mmol/L,Taq酶1.0 U,引物0.3μmol/L,Mg2+2.5 mmol/L,DNA模板2.5 ng/μl。然后对沙打旺ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火试验,得到这条引物的最佳退火温度为54.1℃。这一最佳体系的建立为今后利用ISSR标记技术,研究沙打旺的遗传多样性提供了标准化程序。 相似文献
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以豫杂一号泡桐为材料,通过对影响AFLP技术体系的各主要因素的研究,建立了适于泡桐AFLP分析的技术体系.结果表明最佳酶切体系(20μL)为500 ng模板DNA,3 U的Pst 1和Mse I,在37℃下双酶切3 h;20μL最佳连接体系中为酶切产物15 μL,0.25 μmol·L-1Pst I接头,2.5 μmol·L-1 Mse I接头,1 μL 10×T4 Buff-er,2 U T4连接酶,22℃连接18 h;20 μL最佳预扩反应体系中5 μL稀释10倍的连接产物,100 μmol·L-1dNTP,2 U Taq酶,250 μmol.L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGT/M+AGT),2 μL 10×PCR Buffer.20 μL最佳选择性扩增反应体系中5 μL稀释20倍预扩增产物,100 μmol·L-1dNTP,2 U Taq酶,350 μmol·L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGT/M+AGT),2 μL 10×PCR Buffer.最后,筛选出了97对适宜于泡桐AFLP分析的引物. 相似文献
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科技产业化是推动农业现代化发展、提高农业生产活动效率的主要动力之一。这也是
我国“工业反哺农业、科技兴农”战略下的必然选择。由于农业经济发展水平和农业机械的普及
程度不同,在施工过程中遇到的问题和困难也不尽相同。因此,如何加快农业机械工程技术产
业化建设已成为农村经济发展的关键。 相似文献