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1.
由鸭坦布苏病毒(DTMUV)引起的蛋鸭产蛋急剧下降给我国的养鸭业造成了巨大的经济损失.针对DTMUV E基因保守区域设计一套LAMP引物,利用实时荧光技术建立了DTMUV的实时RT-LAMP病原检测方法.该方法检测RNA的最低检测极限可达到7.8 copies,其灵敏度是普通RT-PCR的100倍,且只能特异性扩增DTMUV的RNA,对其他常见鸭源病毒核酸均无特异性扩增.该方法简单快速、特异性强和灵敏度高,判定结果只需要观察扩增曲线,适用于DTMUV早期感染的诊断、分子流行病学调查和疫情监测. 相似文献
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【目的】利用SYBR GreenⅠ荧光定量技术建立一种相对定量检测坦布苏病毒的方法。【方法】针对坦布苏病毒NS5、E基因分别设计了1对特异性引物,同时设计1对扩增内参基因β-actin引物,将PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,倍比稀释作为质控样品,用于实时荧光定量PCR中NS5、E基因及内参基因β-actin标准曲线的构建,并进行反应的灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】结果显示标准曲线线性关系R2值均在0.99 以上, 检测极限约为1.0E+01拷贝数质粒DNA;特异性结果表明只能检测到坦布苏病毒的扩增曲线;批内和批间重复性试验的变异系数均小于0.5%;用已建立的方法对临床样品进行3次重复检测,病毒RNA的检出率为100%。【结论】本研究初步建立了基于坦布苏病毒NS5、E基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR的方法,为养鸭场诊断和监测坦布苏病毒提供了一种新的特异、灵敏的检测方法。 相似文献
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根据GenBank中登录的鹅细小病毒(GPV)VP3基因序列,利用PrimerExplorer V3软件在序列保守区域没计1套特异识别VP3基因序列中6个不同区段的环介导恒等温扩增(LAMP)引物,并以此套引物建立一种基于LAMP技术的GPV检测方法.结果表明,该方法灵敏度是普通PCR方法的100倍,只能特异性扩增GP... 相似文献
4.
《浙江农业学报》2015,(10)
通过在大肠杆菌中表达鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS5对其纯化,并进行特性分析。根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS5基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR技术扩增得到全长NS5基因序列,并将其定向克隆至原核表达载体p ET32a中,获得重组表达质粒p ET32a-NS5,经双酶切鉴定及测序正确后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。经IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白最终经SDS-PAGE及Western-blotting鉴定。结果显示,NS5融合蛋白分子质量约为120 ku,在诱导后5 h达到表达量高峰,融合蛋白以包涵体形式存在,Western-blotting显示原核表达的蛋白可被兔抗鹅坦布苏病毒血清特异性识别,表明以NS5蛋白为抗原制备的多克隆抗体具有较高的敏感性与特异性。 相似文献
5.
采用SPF鸡胚与vero细胞传代接种法,从江苏某蛋鸡场临床表现为产蛋下降、卵泡萎缩、全身多器官出血为主要特征的发病鸡肝脏、卵巢病料组织中分离一株病毒。该分离毒不能凝集鸡和鹅红细胞, 并对乙醚、氯仿敏感;病毒核酸为RNA;PCR结果排除了分离毒为禽流感病毒、新城疫病毒、产蛋下降综合征病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒;用坦布苏病毒特异引物扩增为阳性, 序列测定与分析结果显示分离毒与GenBank上登录和实验室保存的坦布苏病毒E基因序列同源性在99%以上。上述结果表明分离毒（SN01）可能是一种新的坦布苏病毒,属于黄病毒科坦布苏病毒属,暂称为鸡源坦布苏病毒。 相似文献
6.
自肝脏表现不规则出血的白羽半番肉鸭脏器中分离获得1株病毒(命名为ZZ40株),经(RT-)PCR检测为鸭坦布苏病毒,可被鸭坦布苏病毒高免阳性血清特异性中和。应用鸭坦布苏病毒特异性引物从该株病毒基因组中成功获得结构蛋白基因片段,该片段与近年来我国分离的禽源坦布苏病毒株核酸序列同源性均在99.1%以上,而与蚊媒源坦布苏病毒MM-1775株同源性仅为88.6%;分子进化分析表明该株病毒与BYD-1等近年来的鸭坦布苏病毒分离株共处于一个进化分支。以上结果表明,我国白羽半番肉鸭存在坦布苏病毒感染,且该分离毒株的抗原性与我国早期分离于种(蛋)鸭的坦布苏病毒差异不明显。 相似文献
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采用逆转录环介导等温扩增技术（RT\|LAMP）,建立一种便捷、灵敏的大蒜X病毒（Garlic virus X, GarVX）的快速检测方法。根据GarVX ORF4序列的保守区设计6条特异性引物,分别识别该保守区的8个位点,在反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下对靶序列进行扩增反应。通过条件优化,在65℃恒温条件下温浴60 min可成功检测GarVX。特异性检测结果表明,该方法可特异性检出GarVX,对大蒜A病毒（Garlic virus A, GarVA）、大蒜D病毒（Garlic virus D, GarVD）、大蒜E病毒（Garlic virus E, GarVE）等的检测均为阴性,且检测灵敏度高,最低检出限为5 pg·μL-1,是RT\|PCR方法的10倍。试验结果表明,RT\|LAMP检测方法可快速、特异、灵敏地检测GarVX,并适合现场快速检测。 相似文献
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《（《农业科学与技术》）编辑部》2014,(10)
[目的]建立一种快速、敏感、特异的检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)方法,为诊断与监测BVDV提供准确可靠工具。[方法]根据GenBank公布的BVDV序列,在其保守序列区域设计了一套LAMP引物,优化了反应时间与反应温度,建立了检测BVDV的RT-LAMP方法。[结果]该方法能在56℃等温条件下40分钟完成扩增,扩增结果可通过凝胶电泳梯形带判定。该方法具有良好的特异性和敏感性,最低能检测到3.74×100copies/μl的病毒RNA,而且与其他病毒无交叉反应。[结论]该方法能用于牛病毒性腹泻病毒的诊断与监测。 相似文献
10.
[目的]建立一种快速、敏感、特异的检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）反转录环介导等温扩增（RT-LAMP）方法,为诊断与监测BVDV 提供准确可靠工具。[方法]根据GenBank公布的BVDV序列,在其保守序列区域设计了一套 LAMP引物,优化了反应时间与反应温度,建立了检测 BVDV的 RT-LAMP方法。[结果]该方法能在56℃等温条件下40分钟完成扩增,扩增结果可通过凝胶电泳梯形带判定。该方法具有良好的特异性和敏感性,最低能检测到3.74×100 copies/μl的病毒 RNA,而且与其他病毒无交叉反应。[结论]该方法能用于牛病毒性腹泻病毒的诊断与监测。 相似文献
11.
猪瘟病毒RT-LAMP-LFD检测方法的建立与应用 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】建立一种新型的、能在基层场地进行实时便捷诊断的猪瘟病毒检测方法。【方法】环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)-横向流动试纸条技术(Lateral flow dipstick,LFD)相结合,针对猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)NS5B基因设计一套特异性引物及生物素标记探针,结合异硫氰酸荧光素标记的扩增产物,建立RT-LAMP-LFD检测方法。【结果】所建立的方法能够特异地检测出CSFV的存在,检测PRRSV、JEV、PCV-2等其他病毒均为阴性;所建立的CSFV-RT-LAMP方法对RNA的最低检测限为50 pg;反应快速,整个扩增反应可在1 h内完成;操作简单,不需要PCR仪等复杂的仪器,结果可经肉眼观察。【结论】应用RTLAMP-LFD检测CSFV特异性强、灵敏度高,并且操作安全、简便、快捷,可以满足基层检疫的需要。 相似文献
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环介导等温扩增技术检测菊花中番茄不孕病毒 总被引：2，自引：2，他引：2
【目的】环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种特异、灵敏、快速的新型基因检测技术。本研究拟用该技术建立菊花中番茄不孕病毒(TAV)的检测方法。【方法】设计能识别TAV CP序列6个特定区域的4种LAMP特异引物,对MgCl2、dNTPs、甜菜碱等LAMP反应条件进行优化,利用新建的LAMP法检测TAV,比较LAMP和RT-PCR2种不同方法的检测灵敏度。【结果】建立了检测番茄不孕病毒的LAMP技术;LAMP比RT-PCR具有灵敏度更高、快速、简便等优点。【结论】建立的LAMP技术能快速、准确、简便地检测出菊花中的番茄不孕病毒。 相似文献
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根据GenBank上公布的沙门氏菌invA基因序列中的保守区域,设计一套环介导等温扩增(LAMP)引物,将其用于沙门氏菌的检测,结果成功地扩增出特异性的梯形条带。LAMP方法检测沙门氏菌纯培养的灵敏度为1.04×102 cfu.mL-1,对11株不同细菌进行LAMP检测,仅沙门氏菌获得阳性结果。应用该方法对扬州市场上销售的鸡蛋进行沙门氏菌检测,检测结果与传统培养方法相符合。因此,LAMP方法检测沙门氏菌具有灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便等特点,有望发展成为快速检测鸡蛋中沙门氏菌的有效手段。 相似文献
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为建立鸭巴泰病毒(Batai virus,BATV)的快速检测方法,本研究基于该病毒囊膜蛋白(M)基因序列的保守区域,经优化反应条件,对检测方法的特异性、敏感性及重复性进行了测定,建立了一种用于检测BATV的一步法RT-PCR快速诊断方法。所建立的检测方法可特异性扩增出BATV M基因480bp的序列片段,其最低检测病毒量为1×10~(1.1) TCID_(50),且重复性好,对禽坦布苏病毒、鸭甲肝病毒等5种鸭常见传染病病原均未扩增出相应的片段,特异性好。以上结果表明,所建立的RT-PCR检测方法具有很好的特异性和敏感性,可用于鸭BATV感染的早期快速诊断及流行病学调查。 相似文献
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利用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了简便、可靠的快速检测乙型脑炎病毒JEV(Japanese encephalitis virus)的可视化方法。根据Gen Bank数据库中JEV Henan-09-03毒株(Gen Bank ID:GQ336809.1) E蛋白序列,设计了3对特异性LAMP引物,建立Bst DNA Polymerase等温扩增体系,优化后的反应体系可高灵敏性、特异性检测JEV。本方法通过在扩增产物中加入SYBR Green I染料后用石蜡进行封闭,在可见光下根据反应液荧光的颜色深浅来判断JEV扩增阳性强弱。结果显示,该方法的灵敏度可达5copies·m L-1,且与其他病毒,如乙型肝炎病毒HBV(Hepatitis B virus,HBV)无交叉反应。 相似文献
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为了建立菜豆晕疫病菌的环介导等温扩增方法,本试验利用菜豆晕疫病菌arg K特异性序列设计环介导等温核酸扩增(LAMP)引物,进行反应条件和反应体系的优化,并进行特异性和灵敏度验证。特异性检测结果显示,5株菜豆晕疫病菌的LAMP产物呈阳性结果,而参试的其他病原菌不产生扩增反应。LAMP检测基因组DNA和菌悬液时,其灵敏度分别达到0.632×10-4ng/μl和7.3×102CFU/ml,该方法比常规PCR灵敏度高100倍。表明本研究所建立的LAMP检测方法简便、快速、准确、灵敏,可有效应用于口岸菜豆晕疫病菌的检测。 相似文献
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[目的]建立一种快速、准确的检测瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,为诊断和防治瓜果腐霉菌引起的植物病害提供技术支撑。[方法]通过比较基因组学方法,在瓜果腐霉菌基因组上筛选有序列特异性的基因作为检测的靶标基因,设计LAMP特异性引物,建立一种基于颜色判定的快速、准确的LAMP检测方法,随后对该检测方法的特异性、灵敏度和发病组织实际检测等进行分析评价。[结果]鉴定到1个编码Trypsin蛋白酶的基因是瓜果腐霉菌特异的基因,以该序列作为靶标建立了LAMP检测方法。在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为指示剂,在等温条件(64℃)下进行核酸扩增反应60 min,即可通过肉眼直接观察结果,HNB显示天蓝色即为阳性反应;同时,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证为梯形条带,也可判定为阳性反应。特异性试验中,建立的LAMP检测方法能将瓜果腐霉菌和其他病原菌区分开。灵敏度试验中,LAMP检测方法的最低检测限为100 pg·μL-1,与Real-time PCR反应灵敏度一样,是普通PCR反应灵敏度的100倍。发病组织实际检测试验中,该LAMP方法能检测出人工接种发病植株中的瓜果腐霉菌。[结论]成功建立了一种适用于基层使用的针对瓜果腐霉菌的快速检测技术,为该菌所致病害的准确诊断奠定了技术基础。 相似文献
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参照GeneBank已登录的黄病毒基因序列设计通用引物,建立基于黄病毒通用引物的巢式PCR检测体系,为黄病毒特别是新发黄病毒提供了高效的检测方法。该方法通过基因组的比对,选择NS5基因保守区设计了4条通用简并引物Flav P1～Flav P4,在此基础上建立了巢式PCR反应体系,并应用到鸭黄病毒的检测中。该体系仅能扩增鸭黄病毒目的基因而不能扩增其他病毒,且敏感性达到90copies.μL-1,比普通PCR高出1 000倍。同源性和进化分析表明,鸭黄病毒属蚊媒黄病毒类恩塔亚病毒群,与坦布苏病毒及近期发现的BYD病毒关系最近。以上结果表明,设计的黄病毒引物具有良好的通用性和特异性,其巢式PCR敏感性高,该体系成功地进行了鸭黄病毒的检测,验证了该方法的敏感性和特异性。 相似文献
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【目的】分离鹅源坦布苏病毒,并研究其对雏鹅的致病性。【方法】用RT-PCR方法对江苏省3个鹅场送检的产蛋期病鹅样品进行检测;对坦布苏病毒核酸阳性的样品进行病毒分离,测定分离病毒的生物学特性和E蛋白基因序列。【结果】这些样品中坦布苏病毒呈阳性;从病料中分离鉴定一株病毒,命名为SHYG。E蛋白基因序列同源性比对显示其与中国鸭源坦布苏病毒同源性达到99.3%;生物学特性研究表明该病毒可致Vero细胞病变,对小鼠无致病性,接种2周龄雏鹅出现精神沉郁、腹泻、神经症状甚至死亡;组织学变化可见肝脏淤血、胆小管扩张、脂肪变性;肺淤血、炎性渗出及含铁血黄素沉着,脾脏网状内皮细胞空泡化,肾出血,脑充血、胶质细胞增生。【结论】坦布苏病毒SHYG株对雏鹅有较强的致病性。 相似文献
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为明确禽坦布苏病毒包膜蛋白E的基因特征,运用RT-PCR从已经分离鉴定的禽坦布苏病毒中扩增出其包膜蛋白E全基因,并进行克隆测序和分析。结果表明,禽坦布苏病毒包膜蛋白E全长为1503bp,编码501个氨基酸。所编码的包膜蛋白E大小为54.217ku,理论等电点为6.89,不稳定系数为25.48,属于稳定蛋白质类。利用TMHMM2.0进行跨膜区分析发现,该蛋白的拓扑结构为o442-464i471-489o。本试验株包膜蛋白E和北京鸭源坦布苏病毒（GenBank号：JF459991）同源性最高,达99.8％,和雌麻鸭源坦布苏病毒（GenBank号：JQ928189）核苷酸同源性最低,为98.2％,不同来源（鸡源、鸭源、鹅源、鸽源和蚊子源）坦布苏病毒包膜蛋白E同源性均较高,没有表现出宿主特异性。 相似文献