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对农杆菌LBA4404转化柚木愈伤组织的适宜条件进行了优化．结果表明;LBA4404转化柚木愈伤组织的适宜预培养时间为11～15d,菌液光密度为0．5～0．8,共培养时间为13d,共培养的pH为5．6～6．2;重新悬浮的作用明显,乙酰丁香酮的作用不明显;不同无性系对LBA4404侵染的敏感性不一样,选择适宜的无性系可显著提高转化效率． 相似文献
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国槐遗传转化体系的优化 总被引：1，自引：0，他引：1
采用根癌农杆菌介导的国槐叶盘转化法,在建立修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(sck)转化体系过程中,对影响农杆菌转化频率的各种因素进行研究.结果表明:国槐叶片需在黑暗条件下在MS培养基上预培养5天,农杆菌菌株选用GV3101,农杆菌共培养3天较合适;农杆菌菌液浓度OD600约为0.7,感染时间10 min;侵染前的菌液和共培养基中添加200/μmol·L-1乙酰丁香酮(AS)对国槐遗传转化有明显的促进作用;抑制农杆菌生长的抗生素浓度以头孢霉素(Cef)500mg·L-1最好.PCR和Southern blotting检测证实sck基因已整合到国槐基因组中. 相似文献
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农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织遗传转化体系 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】优化杜仲叶片愈伤组织的再生体系,研究愈伤组织对抗生素和抑菌剂的敏感性,探索影响农杆菌介导杜仲愈伤组织遗传转化的最适转化因子水平,构建农杆菌介导的杜仲愈伤组织瞬时转化体系,使杜仲成年植株外植体为受体的遗传转化成为可能,为杜仲基因功能的研究与定向改良奠定基础。【方法】以杜仲成年植株叶片为材料诱导愈伤组织,通过添加不同浓度植物生长调节剂与大量元素的MS培养基进行不定芽的诱导与增殖,确定最适培养基。在此基础上,在培养基中添加不同浓度抗生素及抑菌剂,研究愈伤组织对其敏感性。以获得的叶片愈伤组织受体系统为基础,通过L_(16)(4~5)的正交试验,探索不同转化因子对农杆菌介导叶片愈伤组织遗传转化的瞬时转化效率的影响,建立最适瞬时转化体系。使用获得的瞬时转化体系对愈伤组织进行遗传转化操作,筛选抗性芽,对抗性芽进行GUS组织化学染色与PCR检验。【结果】再生体系优化的结果表明,3/4大量元素浓度的MS培养基能够促进杜仲愈伤组织不定芽的诱导及生长;愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS+0. 27μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,诱导率为83%±10. 0%;不定芽复壮的最适培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,平均伸长长度为(2. 47±1. 33) cm。抗生素与抑菌剂敏感性试验表明,遗传转化的选择培养基中,抑菌剂头孢霉素的最适浓度为200 mg·L~(-1),筛选用的抗生素卡那霉素最适浓度为70 mg·L~(-1)。转化因子的正交试验表明,最适的农杆菌介导杜仲叶片愈伤组织遗传转化的转化因子组合为:预培养5天、侵染10 min和共培养3天。使用最适瞬时转化体系对约200个愈伤组织进行遗传转化操作,共筛选获得3个抗卡那霉素的抗性芽; GUS组织化学染色显示GUS基因在抗性芽中得到了表达,PCR检测证明这些抗性芽中存在NPTⅡ基因。【结论】杜仲叶片愈伤组织诱导不定芽的最适培养基为3/4MS+0. 27μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA,不定芽复壮的最适培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA。农杆菌介导的杜仲叶片愈伤组织瞬时转化体系为:预培养5天、侵染10 min和共培养3天,筛选培养基为3/4MS+0. 054μmol·L~(-1)NAA+4. 4μmol·L~(-1)6-BA+200 mg·L~(-1)Cef+70 mg·L~(-1)Km。利用此体系共获得3个抗性芽,PCR分析和GUS组织化学染色都表明T-DNA已整合到抗性芽基因组中。 相似文献
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通过提高生长温度和化学消除剂相结合的方法对菌株LBA4404中的质粒进行消除。将过夜培养的工程农杆菌LBA4404接种于含SDS(0%~0.08%)的新鲜YEB培养基中,于42℃震荡培养72h。当SDS的浓度大于或等于0.06%时,菌体不能生长。SDS的亚致死浓度为0.05%。菌液稀释后涂YEB平板,将所有单菌落分别对应影印到普通YEB平板和抗性平板,检测由质粒编码的str和rif基因是否丢失,质粒的DNA电泳图像证实了LBA4404的衍生株3号、11号中的质粒已完全被消除,25号的质粒带明显变淡。 相似文献
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《林业科学》2021,(8)
【目的】以楸树胚性愈伤组织为受体,建立有效的楸树遗传转化体系,为今后楸树性状的遗传改良奠定基础。【方法】通过农杆菌EHA105介导以胚性愈伤组织作为外植体进行遗传转化,通过正交试验获得最优的遗传转化条件,进而将外源基因转入到楸树基因组中。【结果】在1/2 MS培养基中添加不同梯度浓度的卡那霉素(Kana)进行选择压力筛选,在添加了60 mg·L~(-1)Kana的1/2 MS培养基中,楸树胚性愈伤组织的分化率为0.00%,存活率仅为5.71%,因此确定60 mg·L~(-1)为遗传转化的选择压。采用正交设计L18(37)进行农杆菌介导的楸树遗传转化试验,通过GUS化学组织染色统计瞬时表达率,正交试验直观分析和单因素方差分析结果表明:在预培养时间为2天,采用农杆菌菌株EHA105、菌液浓度OD600值为0.7、添加乙酰丁香酮(AS)浓度为300μmol·L~(-1)、侵染时间为10 min,共培养时间为5天的条件下,农杆菌介导的转化效率最高,且对转化效率影响最大的2个因素是乙酰丁香酮浓度和预培养时间。对浸染后的胚性愈伤组织进行8个月的筛选培养,共获得32个抗性组织团,对其中15个增殖较多的抗性愈伤组织进行PCR检测,表明86.67%的抗性组织团中有外源基因整合到楸树基因组中。内源激素水平会对植物体细胞胚分化产生影响,细胞分裂素(CTK)和脱落酸(ABA)促进体胚发生,生长素(IAA)和赤霉素(GA)对体胚发生有抑制作用。通过测定内源激素可知,转基因的抗性组织中内源CTK和ABA水平显著低于野生型的楸树胚性愈伤组织,而内源IAA和GA则显著高于野生型胚性愈伤组织,推测内源激素水平可能是转基因抗性组织体胚分化能力比较差的原因。【结论】建立了农杆菌介导的楸树胚性愈伤组织的遗传转化体系,对筛选获得的15个抗性愈伤组织进行PCR检测,其中13个抗性愈伤组织中有外源基因的整合。内源激素水平的变化可能是导致楸树转基因抗性愈伤组织难以分化的原因。 相似文献
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从2006年4月开始进行四倍体刺槐引种栽培试验,3年多的观测试验结果表明,各类型四倍体刺槐适应性强,对土壤要求不严,耐干旱瘠薄,但以在疏松、肥沃、湿润的土壤中生长较快.不同立地条件,饲料型四倍体刺槐组培苗的高、径生长差异极显著;饲料型和速生型四倍体刺槐根繁苗的高、径生长也具有较大差异.同一立地条件,饲料型四倍体刺槐组培苗的高、径生长均显著大于饲料型和速生型四倍体刺槐根繁苗,也略大于二倍体刺槐;饲料型四倍体刺槐组培苗的叶片逐渐发黄和几乎全部脱落时间也较根繁苗晚10 d左右.饲料型四倍体刺槐组培苗是一个具有推广价值的荒山造林和园林绿化优良树种. 相似文献
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红叶石楠愈伤组织的诱导 总被引：5，自引：0，他引：5
研究了外植体类型、植物生长调节剂组合、光暗处理对红叶石楠品种"红罗宾"愈伤组织诱导的影响,结果表明:在NAA和BA不同配比的MS培养基上,均能从叶柄、叶片和节间诱导出愈伤组织;综合愈伤组织诱导率和愈伤组织松脆性,以叶柄和叶片在添加NAA 0.1 mg/L和BA 0.5 mg/L的MS培养基上诱导产生的愈伤组织最佳.叶柄和叶片诱导的愈伤组织能维持松脆状;节间发生的愈伤组织易转变为水渍状.暗培养可以抑制色素的产生从而有利于获得松脆的愈伤组织;春季愈伤组织的诱导率明显高于秋季. 相似文献
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以烟草无菌苗叶片为外植体,利用叶盘法,将含生长素应答基因(auxin response factor,ARF)的根癌农杆菌LBA4404携带双元质粒载体(pBin438)介导进行遗传转化.结果表明:诱导烟草叶片不定芽的最佳分化培养基为MS 0.8 mg.L-16-BA 0.05mg.L-1NAA,生根培养基为1/2MS 0.02 mg.L-1IBA 0.02 mg.L-1NAA,分化率、生根率分别为96.9%、96.7%;将预培养3 d的外植体与农杆菌菌液浸染3~5 min后,共培养2~3 d,然后转化到含Km75 mg.L-1的选择培养基上进行分化筛选,再转入Km为75 mg.L-1、100 mg.L-1的培养基上进行生根筛选,生根率为66.1%;与对照相比,转基因烟草在形态上发生了明显的改变,叶片颜色变深绿,叶片增厚,主叶脉变粗壮等.PCR扩增,获得40株阳性转基因苗,证明ARF基因已导入烟草中. 相似文献
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国槐离体再生及抗虫基因sck的转导 总被引：3，自引：0，他引：3
以国槐叶片作为外植体,筛选出诱导不定芽分化的最佳培养基;利用根癌农杆菌介导法将经过修饰的广谱抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂基因sck(Signal-CpTI-KDEL)导入国槐.国槐叶片与农杆菌共培养结束后,转移至筛选培养基MS BA 3 mg·L-1 IAA 0.05mg·L-1 G418 8 mg·L-1 Cef 500mg·L-1上.不定芽在培养基1/2MS IBA 1.0 mg·L-1 G418 10 mg·L-1 Cef 100 mg·L-1上进一步培养获得完整再生植株.通过PCR和Southern blotting检测证明,修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因sck已成功导入国槐细胞. 相似文献
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反义PSY基因植物表达载体的构建及其对中国水仙的转化 总被引：7，自引：0，他引：7
实验从中国水仙花瓣中分离得到该基因的572bp的片段，将该片段反向连接到pCAMBIA1301双元载体质粒上，得到CaMV 35S组成型启动子的表达载体pCAM35S-PSY，用“冻融法”将pCAM35S-PSY质粒转入农杆菌LBA4404和EHA105两个菌株中。PCR扩增和酶切鉴定结果表明，所构建的反义表达载体pCAM35S-PSY是正确的并已经成功导入农杆菌中。随后，按照业已建立的遗传转化体系对中国水仙进行了遗传转化，得到了转基因抗性芽。 相似文献
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紫叶桃是重要的园林彩叶树种,叶色美丽,观赏期长,具有很高的园林应用价值。以紫叶桃的叶片和嫩茎段为外植体,用不同浓度生长调节物质进行愈伤组织诱导试验,建立紫叶桃的再生体系。结果表明,诱导愈伤组织时,MS＋2mg／LBA＋1mg／L2,4-D对叶片诱导效果最佳,其诱导率达80％;MS＋1mg／LBA＋1mg／L2,4-D对茎段诱导效果最佳,其诱导率达100％。在MS＋1mg／LBA＋1mg／L NAA培养基上愈伤组织能直接分化出不定芽。 相似文献
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林芝地区引种四倍体刺槐叶片营养成分初报 总被引：6，自引：0，他引：6
对林芝地区引种的四倍体刺槐叶片营养成分进行分析研究,结果表明:(1)饲料型四倍体刺槐含水率比本地普通刺槐高2.45个百分点,全K比普通刺槐高0.0586个百分点,粗蛋白比普通刺槐高2.5488 个百分点;(2)饲料型四倍体刺槐叶片营养元素Ca、Mg、Cu、Fe、Zn的总量为0 4670mg/kg,而普通刺槐叶片营养元素总量为0.2072mg/kg,比普通刺槐的高0.2598mg/kg;(3)引种栽培四倍体刺槐除了Zn含量低于普通刺槐外,其他各项营养成分均高于普通刺槐,作为农牧区畜禽饲料,四倍体刺槐有较高的经济价值和社会效应。 相似文献
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农杆菌介导慈竹4CL基因遗传转化梁山慈竹 总被引：4，自引：0，他引：4
以梁山慈竹2种类型成熟胚的愈伤组织为材料,采用农杆菌遗传介导的方法,将已构建好的具有降低木质素含量的PBI121-4CL-RNAi表达载体导入愈伤组织,探讨愈伤组织预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间和温度对遗传转化的影响。研究结果表明,淡黄色、颗粒状、疏松易碎的胚性愈伤组织是较好的遗传转化材料。以在愈伤组织培养基上预培养8天的淡黄色、颗粒状、疏松易碎的胚性愈伤组织为转化受体,在菌液浓度为OD600=0.05的EHA105中侵染20min后,在25℃、黑暗条件下共培养2天(共培养基表面加一层无菌滤纸),在含有卡那霉素为55mg.L-1的抗性筛选培养基上筛选30天,抗性愈伤组织率为90%,经PCR检测,慈竹4CL基因已导入梁山慈竹愈伤组织中。抗性愈伤组织在芽诱导培养基上诱导30天,可获得丛生芽,待丛生芽长至3～5cm后,在生根培养基上经过20～30天的诱导,可产生1～8条根,获得再生植株。经PCR检测,慈竹4CL基因已导入梁山慈竹再生植株中,获得了转基因植株,转化效率为9%。RT-PCR检测结果表明,转4CL基因的梁山慈竹愈伤组织和植株的内源4CL基因的表达受到抑制,且表达量比对照明显降低。 相似文献