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1.
寻找一种适合牛胚胎干细胞生长的饲养层对成功培育牛胚胎干细胞有重要意义.本研究采用不同浓度国产丝裂霉素处理的SIM小鼠(Mus musculus)成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐鸟苯苷亚系(STO细胞)作为饲养层培养牛胚胎干细胞,为牛胚胎干细胞培养体系的建立提供实验依据.用10、15、20、30和40 μg/mL国产丝裂霉素分别处理1.5、3.0和4.0 h的STO细胞;形态学观察不同代次STO细胞生长状态,并对生长在以STO细胞为饲养层的牛胚胎干细胞进行碱性磷酸酶染色(AKP)、阶段特异性胚胎细胞表面抗原-4(OCT-4)和阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)免疫组化检测、体外分化形成拟胚体等实验.结果显示,当丝裂霉素的浓度为15 μg/mL处理3.0 h可有效的抑制细胞分裂;STO细胞在5～10代作为饲养层细胞形态最好且获得的牛胚胎干细胞AKP染色及OCT-4和SSEA-1抗原表达均成阳性,分别在体外分化培养形成了拟胚体.结果证明使用国产丝裂霉素能有效地处理STO细胞且在以STO细胞作为饲养层培养的牛胚胎干细胞能保持未分化状态,可以作为常规饲养层培养牛胚胎干细胞. 相似文献
2.
影响人类胚胎生殖细胞分离克隆的因素 总被引：7，自引：0，他引：7
探讨胚龄培养液、细胞因子、饲养层细胞等因素对人类胚胎生殖细胞分离克隆的影响。以4～13周龄流产胎儿生殖嵴或性腺为材料，小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)、人胎儿成纤维细胞(hEF)、STO细胞和牛胎儿成纤维细胞(bEF)作饲养层，高糖DMEM(Dulbecco's minimum Eagle’s medium)为基础培养液，添加10^-4mol／L 2Me(2-巯基乙醇)、胎牛血清(FBS)或新生牛血清(NBS)、白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、干细胞冈子(SCF)等为培养液，探讨影响人类胚胎生殖细胞分离克隆的因素。结果表明7～12周流产儿适于人类胚胎生殖细胞的分离克隆；人类胚胎生殖细胞体外培养以添加15％FBS为宜：添加4ng／mL LIF 4ng／mL bFGF 20ng／mL SCF能明显改善人类胚胎生殖细胞的分离克隆；MEF、STO、bEF和hEF可提高人原始生殖细胞(PGCs)的贴壁率，能促进PGCs源的人类胚胎干细胞(ES)的分离效率；以MEF作为饲养层效果较好。 相似文献
3.
《农业生物技术学报》2014,(9)
正动物干细胞与胚胎工程研究,在家畜繁殖育种和转基因动物克隆方面发挥着重要作用,同时补充了转化医学研究无法开展的工作。本期特设了"动物干细胞与胚胎工程"专题,集中展示了该研究领域的部分研究成果,以增进读者对该领域研究进展的了解。多能干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞类群,其主要特性是具有发育成3个胚层细胞和特定功能组织器官的能力。通过体外培养建系获得多能干细 相似文献
4.
小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)作为胚胎干细胞培养的饲养层细胞,受到细胞代次等因素限制,需要长期反复制备,消耗大量的实验动物。寻找可替代小鼠胚胎成纤维细胞支持干细胞生长增殖的稳定细胞系,对于降低干细胞的培养成本和减少工作量具有重要意义。L-Wnt3a细胞是一个能够稳定向细胞外分泌Wnt3A蛋白的永生细胞系,目前尚不清楚其是否支持小鼠胚胎干细胞的培养。本研究探讨L-Wnt3a作为饲养层细胞对于小鼠(Mus musculus)胚胎干细胞系的建立以及该细胞条件培养液对无饲养层培养小鼠胚胎干细胞的影响。实验结果表明,丝裂霉素C浓度为10μg/mL,作用4 h时,可显著抑制L-Wnt3a细胞的体外生长而不影响细胞的活力。用该细胞制备饲养层,原代分离、培养小鼠胚胎干细胞,成功建立小鼠胚胎干细胞系。利用L-Wnt3a细胞制备条件培养液进行胚胎干细胞的培养,结果显示,L-Wnt3a条件培养液可支持小鼠胚胎干细胞在无饲养层条件下自我增殖,该条件下培养的胚胎干细胞表达碱性磷酸酶、Oct4、Sox2、Nanog、E-cadherin(E-CAD)和SSEA-1多能性因子,并能够在体内、外分化为3个胚层,形成嵌合体后代。L-Wnt3a细胞作为饲养层细胞,能够成功分离获得小鼠胚胎干细胞,可以避免小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞存在的代数限制、制备繁琐等问题;并且LWnt3a条件培养液可以在无饲养层条件下维持小鼠胚胎干细胞的自我更新,能够在一定程度上有效避免饲养层细胞对胚胎干细胞造成的不利影响。 相似文献
5.
猪胚胎干细胞培养、分离和传代 总被引：4，自引：0，他引：4
摘要:利用五指山小型猪近交系不同发育阶段的早期胚胎为材料，探索猪胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)培养、分离、传代的影响因素，以选择猪胚胎干细胞建系的适宜条件。收集五指山猪第5～10 d胚胎(配种当天记为0 d)，以 STO细胞[STO细胞是来自SIM小鼠(S)胚胎对硫代鸟嘌呤(thioguanine,T)和乌本苷(ouabain,O)有抗性的成纤维细胞系]为饲养层，分别采用两种培养液: 杜氏培养液(Dulbecco's modified eagle medium ，DMEM) + 10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）+ 10 %新生牛血清（newborn bovine serum，NBS）+1 000 IU/mL白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）+ 30 ng/mL干细胞生长因子（stem cell growth factor , SCF）+20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor ，bFGF)或DMEM + 10% NBS + 10% FBS + 1 000 IU/mL LIF + 30 ng/mL SCF。比较发现，培养液中是否加入bFGF对胚胎干细胞的培养无显著影响；实验共收集胚胎124枚，其中D5～6胚胎18枚，胚胎贴壁率为68.8% ，内细胞团出现率为6.3% ，未能传代；收集D7孵化囊胚27枚，贴壁率为100% ，内细胞团出现率为38.9% ，传代1次失败；D9胚胎18枚，贴壁率为100%，传代后ES细胞生长较缓慢；收集D10胚胎52枚，胚胎贴壁率为100%，传代率为100%，传代后可出现ES细胞克隆点；实验过程中比较了胚径对干细胞培养的影响，发现胚径越大，培养效果越好，胚径大于100μm,分离ICM后出现干细胞集落成功率达100%，并得到了AP染色呈阳性的传4代的ES细胞集落。 相似文献
6.
牛早期胚胎性别鉴定体系的建立和优化* 总被引：13，自引：3，他引：13
根据牛SRY基因5’调控区序列设计合成了2对巢式PCR引物作为公牛特异的性别鉴定引物，根据牛酪蛋白基因序列设计合成了l对引物作为内标基因引物，建立了牛早期胚胎性别鉴定的PCR反应体系，同时对微量牛胚胎细胞DNA的提取方法、巢式PCR和常规PCR的灵敏度进行实验，以便建立适合在生产实践中应用的牛胚胎性别鉴定技术。结果表明，设计使用的性别鉴定引物公牛特异，所有引物牛特异。煮沸法和反复冻融法都可应用于微量牛胚胎细胞DNA的提取。实验所使用的巢式PCR只要10个以上细胞就可看到扩增结果，适合在胚胎性别鉴定中使用。在建立了胚胎性别鉴定的PCR反应体系后，鉴定了10枚奶牛胚胎的性别，目前已产下两头犊牛，其实际性别和鉴定结果相一致。 相似文献
7.
多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)作为一类重要的细胞资源,成为目前国内外的研究热点,获得这类细胞在当今医学研究和生物技术的发展及应用中具有重要的意义。猪(Sus scrofa)由于其生理结构和代谢特征与人(Homo sapiens)较为相似,成为动物多能干细胞建系的重点研究对象。然而目前,猪多能干细胞建系工作仍存在很多难题。本文将从猪多能干细胞建系研究的进展和存在的问题入手,对照小鼠(Mus musculus)和人相关研究的成功经验,总结目前已经报道的猪多能干细胞的培养条件、调控因子、信号通路和基因表达特征,以期为建立猪胚胎干细胞和诱导多能干细胞系提供参考。 相似文献
8.
以昆明系小鼠(Mus musculus Km)胚胎为材料,以丝裂霉素(10 μg/mL)处理的MEF为饲养层,研究了在胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)培养液中分别添加血清替代物(knockout serum replacement,KSR)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和FBS PD98059(50 μgol/L)对昆明系小鼠胚胎贴壁、内细胞团(inner cell mass,ICM)集落形成及ESCs分离培养的影响.结果表明,在ESCs培养液中添加KSR,胚胎贴壁率显著低于添加FBS(P<0.05),ICM集落形成率和1代ESCs集落出现率差异不显著(P>0.05),2～5代ESCs集落出现率显著高于添加FBS(P<0.05),2株ESCs传到7代;在ESCs培养液中添加FBS PD98059,胚胎贴壁率、ICM集落形成率和1～5代ESCs集落出现率均显著低于添加KSR或FBS(P<0.05);用0.5 g/L胰酶 0.2 g/L EDTA离散消化ICM细胞和ESCs并结合机械分割,1～5代ESCs集落出现率显著高于用2.5 g/L胰酶 0.2 g/LEDTA(P<0.05).实验结果表明,在ESCs培养液中添加KSR,较添加FBS或FBS PD98059更适合用于分离培养昆明系mESCs,用0.5 g/L胰酶 0.2 g/L EDTA离散消化ICM细胞和ESCs并结合机械分割优于用2.5 g/L胰酶 0.2 g/L EDTA. 相似文献
9.
牛胚胎的多代克隆 总被引：3，自引：1，他引：2
范必勤 《农业生物技术学报》1999,7(4):307-310
牛胚胎多代克隆的目的是通过重复细胞核移植产生大量的胚胎和牛犊。现已建立了一些重要的方法,例如：采用体外成熟的卵细胞为南受体;第二次减数分裂未期法核的先进技术;采和体外成熟,体外受精和体外培养形成的胚胎以及经冷冻保存的胚胎为核供体;核移植胚体外培养可发育至囊胚期;克隆胚可冷冻长期保存等。迄今已连续克隆６代获得囊胚期胚胎,移入受体母牛产生了第１～３代的克隆牛。从１枚牛胚胎通过３代克隆获４３枚胚胎,通过 相似文献
10.
多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)包括从胚胎内细胞团中分离出的胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs),外胚层干细胞(epiblast stem cells,EpiSCs),从原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)分离出的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,EGCs)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs).这些细胞都具有向各种类型细胞发育的潜能,因此,PSCs为再生医学的发展,人类基因疾病的动物模型的建立,异种器官移植和高质量抗病新品种的培育提供了有效的途径.迄今为止,PSCs在小鼠(Mus musculus)模型和人类物种已经做了大量研究,同时,家畜的ESCs和iPSCs也取得了有效的进展,表明其不仅可以应用于特定家畜优良品性的稳定遗传和优育,而且可以以家畜为载体生产人类需要的化学药品和抗体,甚至应用在人类疾病的临床前应用中.然而,家畜的ESCs相对来说是难分离和富集的,体外培养建立稳定的ESCs系具有更大的难度和挑战.近年来,得益于对家畜ESCs和相关iPSCs相关的持续研究,已初步揭示了家畜ESCs的独特生物学特性.PSCs已经成为生命科学和高科技农业和生物学一个创新的研究领域.在本文中,本文综述了家畜PSCs的发展历程与应用前景. 相似文献