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细胞周期蛋白M2(CNNM2)是参与体内镁离子平衡的重要候选基因,本实验采用的CRISPR/Cas9 系统是最近几年发展起来的一类新型的基因打靶技术。在斑马鱼CNNM2基因的一号外显子处选取打靶位点,构建sgRNA表达载体。随后将体外转录的sgRNA和Cas9 mRNA混合物分别以约30pg和300pg的剂量显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中实现对目的靶基因CNNM2的敲除。24h-48h后PCR产物回收,限制性酶切法初步检测基因打靶情况,最后进行测序分析确定突变类型。为进一步验证突变的稳定遗传性,选择了具有敲除效率F0与野生型斑马鱼进行外交,对获得的F1进行逐一剪尾,提取DNA进行PCR和测序分析。结果显示F0和F1均获得了不同程度插入,缺失和移码突变类型,且F0突变效率为88%。本研究获得了能稳定遗传的CNNM2基因敲除斑马鱼个体,并为将来进一步研究CNNM2基因和机体镁离子稳态之间的关系打下了基础。 相似文献
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【目的】探究同源臂长度对CRISPR/Cas9系统介导人乳铁蛋白基因（hLF）打靶山羊β-乳球蛋白基因（BLG）座位点效率的影响,为今后体细胞核移植制备BLG -/hLF +基因打靶山羊提供科学依据,也为CRISPR/Cas9基因编辑系统介导BLG基因或其他基因座位点定向精准分子修饰的遗传育种提供借鉴。【方法】针对山羊BLG基因第一外显子区域设计构建sgBLG/Cas9载体,电转染山羊胎儿成纤维细胞,PCR验证BLG基因座位点致突变活性;以BLC14乳腺特异性表达载体为基础构建3种同源臂长度（6.0、3.5和1.2 kb）的hLF基因打靶载体,分别与sgBLG/Cas9载体共转染山羊胎儿成纤维细胞,经500 μg/mL G418筛选后,采用PCR检测基因打靶情况。【结果】sgBLG/Cas9载体在山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座附近切割DNA双链的致突变活性效率在30%~35%。构建获得3种同源臂长度的hLF基因打靶载体（BLC14-1、BLC14-2和BLC14-3）,对应的同源臂长度分别为6.0、3.5和1.2 kb;将3种hLF基因打靶载体与sgBLG/Cas9载体共转染山羊胎儿成纤维细胞,经5次电转染和G418筛选,分别获得83、77和86株药物抗性细胞,经PCR同源重组检测最终获得42、38和44株BLG -/hLF +基因打靶细胞株,即hLF基因在山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座的平均打靶效率分别为50.6%（42/83）、49.4%（38/77）和51.2%（44/86）。3种不同长度同源臂构建的hLF基因打靶载体在山羊BLG基因座位点的打靶效率在统计学上无显著差异（P>0.05）,表明同源臂长度对CRISPR/Cas9介导hLF基因打靶山羊BLG基因座位点无显著影响。【结论】利用CRISPR/Cas9系统介导hLF基因打靶山羊胎儿成纤维细胞BLG基因座位点能成功获得多株hLF +/BLG -基因打靶细胞株（BLG基因座定点打靶hLF基因）,但打靶载体同源臂长度对CRISPR/Cas9系统介导BLG位点定向整合hLF基因的打靶效率无明显影响。 相似文献
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基因打靶是反向遗传学研究的重要工具,在植物基因功能研究等方面具有重要意义。正负筛选系统是一种筛选发生正确基因打靶转化株的方法,能够减少筛选的工作量,使植物基因打靶效率大大提高。通过近些年的研究改进,正负筛选在植物基因打靶研究中的应用逐渐成熟,就植物基因打靶研究中正负筛选系统的原理及研究进展进行综述,对今后的基因打靶研究具有重要的参考价值。 相似文献
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简要介绍了转基因技术、基因打靶以及胚胎干细胞的性质特点,详细阐述了胚胎干细胞途径的基因打靶技术的原理、方法及应用。胚胎干细胞途径的基因打靶包括以下几个步骤:选择合适的ES细胞系、构建外源DNA片段打靶载体、目的基因筛选、ES细胞的转化、ES细胞的药物筛选、抗性克隆的分离与扩增、PCR与SOUTHERN印记、基因打靶小鼠的获得-嵌合体制作。以期为胚胎干细胞和基因打靶技术的进一步研究提供方法。 相似文献
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多位点基因打靶的定点整合效率研究 总被引：1，自引：0，他引：1
利用PCR方法从pEGFP-N1中扩增pCMV-EGFP,从人基因组rDNA基因家族靶基因插入位点两侧分别扩增两条基因打靶同源重组引导序列DS1和DS2,将DS1、DS2片段插入pMD19-pCMV-EGFP中,构建成多位点基因打靶载体pMD19-DS2-pCMV-EGFP-DS1.通过脂质体将其转染至HEK293细胞内.通过荧光检测和PCR、测序等方法,检测和评价定点整合效率.试验结果表明,外源基因EGFP在转染细胞中持续稳定表达,EGFP定点整合率约为4%,不经药物筛选大大提高了整合效率,比传统的基因打靶技术提高了4000多倍,为转基因动物研究建立了高效的定点转基因技术. 相似文献
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本文分析了影响基因打靶效率的因素,并指出提高同源重组利用率和在靶基因位点处引入DNA双键断裂可以提高基因打靶效率,总结了近年来这两方面尝试在植物中的研究进展,并与一些其他物种中的研究作出比较. 相似文献
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【目的】构建猪Jiv90基因的同源打靶载体,并转染猪血管内皮细胞系(SUVEC),对Jiv90基因的敲除效果进行初步验证。【方法】根据NCBI中公布的Jiv90基因序列,克隆得到Jiv90基因核心区两侧的基因序列,并以此为长短臂,构建了可定点敲除Jiv90基因的打靶载体。用该载体转染SUVEC,通过新霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)的筛选得到稳定的细胞株,再利用PCR检测neo基因在细胞基因组上的整合情况,最后对筛选得到的neo阳性细胞进行猪瘟病毒(CSFV)感染试验,并用实时定量PCR(Real-time PCR)检测CSFV的增殖情况。【结果】以提取所得品质良好的SUVEC全基因组DNA为模板,克隆得到了针对Jiv90基因打靶的核心区两侧基因序列,基因片段长度分别为4 522bp和1 944bp。将长短臂与打靶骨架载体pA2T相连后,构建了关于猪Jiv90基因的同源打靶载体JKS。用JKS载体转染SUVEC,通过1 500μg/mL G418和200nmol/mL GANC正负筛选,得到了稳定转染JKS载体的SUVEC。对于稳定筛选后的试验组细胞,感染CSFV并进行Real-time PCR,结果表明,正常细胞中的CSFV核酸含量是转染JKS载体细胞的3.65倍。【结论】成功扩增了针对猪Jiv90基因的同源长短臂,并构建了猪Jiv90基因的打靶载体JKS,敲除Jiv90基因细胞中的CSFV核酸片段含量显著降低,说明Jiv90基因的敲除可降低细胞中猪瘟病毒的增殖量。 相似文献
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为研究人白介素2基因在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达,构建人白介素-2基因的山羊β-酪蛋白位点打靶载体。以质粒pBCI为模板扩增山羊β-酪蛋白上游2．5kb和下游3．5kb的序列作为5’和3’同源臂,将克隆得到的人白介素2基因和neo基因插入到2个同源臂之间,获得山羊β-酪蛋白基因打靶载体pBN153。利用脂质体将重组质粒转染奶山羊胎儿成纤维细胞进行G418筛选,并采用PCR和实时定量PCR方法对人白介紊-2基因在稳定株中的表达进行验证。检测结果表明,本试验构建的打靶裁体pBN153成功转染奶山羊胎儿成纤维细胞,将人白介素2基因成功整合至奶山羊胎儿成纤维细胞基因组中,为通过体细胞核移植法制备人白介素-2基因乳腺生物反应器的研究奠定了基础。 相似文献
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为评估在山羊胎儿成纤维细胞中通过同源重组进行基因打靶的可行性，构建打靶载体pTargetl，分别以山羊β-酪蛋白基因的5’、3’侧翼区为2条同源臂，中间插入正筛选基因(Neo’)，外侧插入负筛选基因(HSV-tk)。将该载体线性化并纯化后电转染人30日龄的山羊胎儿成纤维细胞中，转染细胞系分别用G418和丙氧鸟苷进行正负药物筛选，存活细胞经PCR检测证明发生了同源重组事件。 相似文献
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《内蒙古农业大学学报(自然科学版)》2016,(1)
本研究以内蒙古自治区生物制造重点实验室应用基因打靶技术和TALEN技术获得的靶除FGF5基因的内蒙古白绒山羊为材料,通过对其进行绒毛指标测定,探讨了基因打靶技术和TALEN技术靶除FGF5基因对绒山羊绒毛性状的影响,并在国内外首次将模糊数学的模糊综合评价方法运用于两种基因编辑技术的评价。结果表明与对照白绒山羊相比,基因打靶技术获得靶除FGF5基因绒山羊的绒长度明显降低、细度明显变粗和毛长度明显增加;TALEN技术获得靶除FGF5基因绒山羊的绒长度明显增加。模糊综合评价结果说明在2只不同敲除技术的绒山羊个体中,应用TALEN技术敲除的绒山羊和基因打靶技术敲除的绒山羊在毛被性能改善方面是有差异的。 相似文献
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Opaque-2突变基因(o2)对玉米组合品质的影响(英文) 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]探讨o2突变基因的作用方式,提高玉米品质育种研究水平。[方法]通过对18个普通玉米自交系组配的33个普通玉米组合及相应的导入o2近等基因系(o2-NILs)组配的33个含o2玉米组合品质的比较,分析了导入o2后对玉米组合品质的影响。[结果]o2-NILs组合与普通玉米组合相比,其赖氨酸、蛋白质和油份含量有大幅增加,其余14种必须氨基酸含量也发生了相应的变化,天门冬氨酸、苏氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、组氨酸、精氨酸和脯氨酸含量提高;而丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸含量降低。相关性分析结果表明,天门冬氨酸、精氨酸和苏氨酸变化与赖氨酸变化程度高度相关(>0.8),蛋白质和油份的变化与赖氨酸变化的相关性分别为0.48和0.38,表现为中度相关。33个o2-NILs组合综合品质分析结果表明,o2组合的CAL58×吉477和CA156×196综合品质优良,产量较高,可能具有较大的开发潜力。[结论]该研究结果为今后利用o2对温带玉米种质进行品质改良,并提高改良效率提供了理论和材料基础。 相似文献
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为研究山羊乳蛋白基因编辑,实现羊乳“人源化”改造。利用CRISPR/Cas9系统敲除山羊乳中致敏原β-乳球蛋白（BLG）基因,同时在BLG基因座定点敲入人乳铁蛋白（hLF）基因。针对山羊BLG基因第一外显子设计构建sgBLG/Cas9表达载体经电转染山羊胎儿成纤维细胞验证其编辑活性;将打靶载体BLC14与sgBLG/Cas9载体共转染山羊胎儿成纤维细胞,经筛选检测获得BLG~-/hLF~+打靶细胞株作为供核细胞用于山羊体细胞核移植;通过剖宫产获取克隆胎儿并验证其中靶情况。结果表明：sgBLG/Cas9编辑山羊BLG位点致突变率约为30%～35%;共筛选72株药物抗性细胞株,其中有37株为基因打靶细胞,打靶效率为51.4%(37/72）;挑取形态较好的7株打靶细胞用于核移植,共制备416枚重构胚,移植30只受体山羊;30-35日龄B超诊断有13只受孕,妊娠率为43.3%(13/30）;剖宫产获取3只35日龄克隆胎儿均验证为BLG~-/hLF~+基因型,并建立了BLG~-/hLF~+靶向性修饰细胞系。因此,利用CRISPR/Cas9系统可以获得BLG基因座定点打靶hLF基因的转基因克隆山羊,该研究为培育羊乳中低致敏原和富含hLF功能营养成分的转基因山羊新品系提供了科学依据。 相似文献
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吉林省粮食大县(市)粮食生产效率分析 总被引：2，自引：0，他引：2
《吉林农业大学学报》2015,(4)
以2004—2013年度吉林省前郭县、德惠市、榆树市等14个粮食大县(市)为样本,运用DEA模型从静态和动态2个角度对吉林省粮食大县(市)的粮食生产效率进行了比对分析,并用Tobit模型分析了其主要影响因素。结果表明:德惠市等粮食大县(市)存在投入要素松弛情况;粮食大县(市)粮食生产全要素生产率普遍较低;户均粮食播种面积对生产效率具有显著的正面影响,入社比重对生产效率具有正面影响,户均农机动力则有负面影响。据此提出,吉林省粮食大县(市)需要合理配置要素的投入,提高农民合作社服务能力和水平,推进土地流转,适度扩大土地经营规模,提高农机设备的利用率。 相似文献
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玉米抗(耐)旱指标鉴定方法与展望 总被引：1，自引：0，他引：1
介绍了玉米抗(耐)性指标的研究方法,简述了抗(耐)旱性研究的措施、综合评价指标研究进展,综合分析了玉米抗(耐)性指标,展望了抗旱性鉴定指标研究的发展方向,以期通过建立玉米抗(耐)性鉴定指标体系,提高玉米抗(耐)性指标鉴定的效率. 相似文献
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[目的]探索活性污泥胞外聚合物(EPS)提取的最佳条件。[方法]比较研究了5种方法(H2SO4法、甲醛-NaOH法、搅拌法、热提法和NaOH法)对活性污泥EPS的提取效果,同时确定了最适提取方法的最优提取条件。[结果]5种提取方法中NaOH法因其提取的DNA含量较少,提取时间较短进而比较适宜。以NaOH法提取EPS,在pH为11,提取时间为10min,搅拌速度在80~120r/min下提取效率最高。[结论]确定的EPS最适提取条件可为其研究提供理论基础。 相似文献
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【目的】猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种对养猪业造成巨大损失的高致死率的传染性疫病。CRISPR/Cas13b系统精准切割和编辑RNA的功能提供了一种靶向抑制RNA病毒的策略。本研究尝试利用CRISPR/Cas13b的RNA干扰功能对PEDV的基因组RNA进行切割,以探索一种新型的PEDV病毒抑制策略。【方法】设计了4对靶向PEDV基因组不同区域的CRISPR RNA(crRNA)位点,构建了CRISPR/Cas13b打靶载体,以打靶载体转染Vero细胞,并利用PEDV感染转染细胞,检测PEDV在CRISPR/Cas13b转染细胞内的增殖情况。【结果】CRISPR/Cas13b系统对PEDV在Vero细胞的增殖具有明显的抑制作用。打靶载体U6-crRNA3和U6-crRNA4转染组相较于正常细胞组,病毒免疫荧光试验中荧光团明显减少;定量PCR结果显示,打靶载体转染组在细胞水平抑制50%以上病毒增殖量。【结论】本研究构建的CRISPR/Cas13b系统能有效抑制PEDV增殖,为开发有效的RNA病毒防控手段、建立抗病动物模型提供了新的研究策略。 相似文献
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[目的]研究土壤氧化锰对Cr(Ⅲ)的氧化反应。[方法]以γ-MnO_2为研究对象,研究了pH、陪伴离子等溶液因素及陪伴矿物对Cr(Ⅲ)氧化的影响。[结果]在0.1~1.0 mmol/L Cr(Ⅲ)溶液中,Cr(Ⅵ)生成量随Cr(Ⅲ)浓度的升高而增大,未达到γ-MnO_2最大氧化容量。Cr(Ⅲ)氧化过程分为快、慢2个阶段,初期较为迅速,而后期则较为缓慢。提高pH抑制了Cr(Ⅲ)氧化,其主要原因是羟基态Cr(Ⅲ)的活性较游离态低;Cu(II)存在同样不利于Cr(Ⅲ)氧化,这时因为前者亦可被γ-MnO_2吸附,从而占据表面氧化位点;同时,Cr(Ⅲ)与EDTA和柠檬酸形成络合物后,也较难被氧化。当氧化铝与γ-MnO_2共存时,由于二者存在竞争吸附Cr(Ⅲ),因而也不利于Cr(Ⅲ)向Cr(Ⅵ)转化。[结论]该研究可为全面了解Cr(Ⅵ)污染风险提供科学依据。 相似文献