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1.
本研究旨在建立一种灵敏、快速检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。参照GenBank中PDCoV有关基因序列,设计一对特异性引物用于扩增PDCoV M 基因。将测序正确的基因片段克隆入pMD18-T载体,构建重组质粒作为建立标准曲线的病毒模板。设计合成一对特异性引物与TaqMan探针,进行反应条件和反应体系的优化,建立快速检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并进行该方法的灵敏性、特异性与重复性验证。结果表明,该方法能有效扩增1.0×10^1 ~1.0×10^9 拷贝·μL^-1 的PDCoV标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系。该方法的检测灵敏度为1.0×10^1 拷贝·μL^-1;对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒等病原不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1%,重复性良好。对2017—2018年期间收集的河南省不同猪场的100份腹泻病料进行检测,PDCoV的阳性检出率为23%(23/100),与PDCoV SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。人工感染PDCoV的仔猪,取攻毒后不同时间的粪便样品,应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度远远优于常规RT-PCR。上述结果表明,本研究所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法能够灵敏、特异地检测PDCoV,可用于临床PDCoV的检测。 相似文献
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为建立鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)的方法,本研究分别针对PEDVN基因、TGEVM基因、PDCoVM基因和PRoVVP6基因设计特异性引物和TaqMan探针,经过优化反应条件,建立了同时检测4种病毒的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法仅特异性扩增PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,与猪其它主要病毒无交叉反应,特异性较强;对PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的质粒标准品的最低检出限分别为2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^1拷贝/μL、2.06×10^3拷贝/μL,具有较高敏感性;组内与组间变异系数均小于1.1%,具有良好的重复性。应用该方法和普通多重RT-PCR检测临床采集的243份腹泻病料样品,两者的符合率为96.71%。本研究建立的方法为临床PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的鉴别检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感、高效的技术手段。 相似文献
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《中国兽医杂志》2020,(2)
猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪Delta冠状病毒(PDCoV)已经成为养猪行业的主要疫病。建立能够同时检测且能区分这2种病毒感染的诊断方法,对于临床实践具有重要意义。根据GenBank中登录的PEDV和PDCoV基因序列,分别用PDCoV M基因和PEDV M基因设计了2对引物,并对PEDV的M基因片段和PDCoV的M基因片段进行扩增,通过对PCR反应条件的优化,建立了检测PDCoV和PEDV双重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法。特异性和敏感度的试验表明,此方法对PDCoV和PEDV核酸的最低检测量分别为3.27×10~3拷贝/μL和3.63×10~4拷贝/μL,具有较高的敏感度;该方法可同时扩增出340 bp(PDCoV)和520 bp(PEDV),但不能扩增出猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒、猪博卡病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒。多重PCR与单一PCR符合率100%。表明此方法可以用于PDCoV和PEDV的检测。 相似文献
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为了快速检测猪德尔塔冠状病毒(PDCoV),针对PDCoV N基因设计特异的引物,建立了猪德尔塔冠状病毒重组聚合酶扩增(RPA)方法。特异性试验中以PPRSV、PEDV、PKV、TGEV和FMDV为模板时均未产生任何条带,特异性较好。该检测方法的灵敏度为103 copies/μL,敏感性较好。用该方法检测194份仔猪腹泻样品,PDCoV阳性率为14.4%,较常规RT-PCR阳性率为11.9%更高。研究所建立的猪德尔塔冠状病毒RPA检测方法具有反应快速、操作简单、结果可靠、设备要求低等优点,可为基层简易实验室提供一种方便适用的快速检测方法。 相似文献
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6.
根据Gen Bank中猪伪狂犬病病毒(PRV)g B基因的保守序列,设计一套特异性引物,在对反应条件进行优化后,建立了PRV环介导等温扩增(LAMP)可视化检测方法。结果显示:该方法能在常规65℃水浴锅中30 min内实现对目的片段的特异性扩增,并且可通过肉眼观察颜色直接判定检测结果 ;该方法具有很高的特异性,与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型等均无交叉反应;该方法的敏感性可达1 fg;将该方法应用于临床样品检测,结果与普通PCR方法一致。研究表明,本研究建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合基层PRV感染的快速检测。 相似文献
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《畜牧与兽医》2020,(9)
旨在建立快速准确检测与猪腹泻相关的猪Delta冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRoV)多重PCR检测方法。针对PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的基因组序列设计了4对特异性引物,分别扩增PDCoV N基因(447 bp)、PEDV M基因(204 bp)、TGEV M基因(612 bp)、PRoV VP6基因(329 bp),经过对反应条件的优化,成功建立了能同时特异性检测PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的多重RT-PCR,且特异性好。应用该检测方法对上海及周边地区养殖场临床猪腹泻病料进行检测,结果检出PEDV阳性样品16份,其中PEDV和TGEV混合感染1份,PDCoV和PRoV均未检出,与单一RT-PCR检测结果完全吻合。该快速检测方法的成功建立,将有助于提高对PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的病原学调查和疾病监测,为生态养殖提供技术储备。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2020,(15)
为了同时检测引起猪只腹泻的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)和猪急性腹泻冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)这三种主要肠道冠状病毒,试验设计3对特异性引物,建立PEDV、PDCoV和SADS-CoV的三重RT-PCR方法,同时进行特异性、敏感性、重复性试验,并检测临床样品对方法进行验证。结果表明:采用建立的三重RT-PCR方法对PEDV、PDCoV和SADS-CoV进行扩增,分别扩增出大小约为486 bp、329 bp和628 bp的特异性片段;该方法对猪瘟病毒、猪传染性肠胃炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒不能扩增出任何片段,特异性好;对PDCoV、PEDV和SADS-CoV的最低检测量分别为1×10~6,1×10~3,1×10~4 copies/μL,具有较好的敏感性;在196份临床样品中,PEDV的阳性检出率为13.27%,PDCoV为12.24%,SADS-CoV为0,同时多重RT-PCR与单项RT-PCR检测方法的符合率均为100%。说明建立的三重RT-PCR方法能够同时特异敏感、高效廉价检测出猪群中PDCoV、PEDV及SADS-CoV这三种肠道冠状病毒,具有快速、便捷和经济的特性,可用于临床大规模流行病学调查和诊断。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2017,(6)
猪丁型冠状病毒(PDCoV)是2014年检测出的一种新型猪源肠道冠状病毒,对养殖业造成严重的经济损失。为建立快速检测PDCoV的血清学方法,本研究以原核表达的PDCoVN重组蛋白为包被抗原,通过反应条件优化,建立了一种PDCoV重组N蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,原核表达的PDCoV重组N蛋白约为28ku,westernblot证实表达蛋白具有良好的反应原性;以其作为包被抗原建立的PDCoV抗体间接ELISA方法仅对PDCoV血清检测为阳性,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒等7种主要猪源病毒阳性血清均无特异性反应,具有良好的特异性。该方法检测灵敏度较高、重复性好,批内和批间重复性变异系数均小于10%;采用该ELISA方法对我国2014年~2016年间采集的不同地区猪场的100份临床血清样品进行了检测,阳性率高于45.9%,表明我国猪群中存在PDCoV感染。本实验建立的ELISA方法可以用于检测临床样品中的PDCoV抗体,是PDCoV流行病学调查的一种有效工具,对该病的防控具有重要意义。 相似文献