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1.
利用来源于水稻白叶枯菌株JXOⅢ的无毒基因avrXa3构建的同源序列突变转化单元,同源重组得到PXO99A菌株的1个缺失突变体PXO99△avr.PXO99A及其突变体基因组DNA以内切酶BamH Ⅰ完全消化后进行同源检测,发现突变体PXO99△avr中有3条杂交带消失,有2条带信号减弱.进一步以相同探针检测PXO99A的基因文库,限制性酶切分析和Southern杂交归类,共获得13个不同的阳性克隆.众多avrBs3/PthA基因在基因组中单独存在,或2个和2个以上串联排列.经比对,克隆p5所含条带与突变体缺失的5条带大小相同.因此认为随机交换产生的突变体中有5个基因被敲除.将此文库克隆(p5)分别导入PXO99A和突变体PXO99△avr中,苗期接种试验表明:p5互补突变体能使其毒性恢复接近PXO99A的致病表型,推测此克隆正是突变体缺失的基因.同时也表明:缺失的5个串联基因的综合作用主要表现为毒性功能. 相似文献
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对同源重组获得的水稻白叶枯病菌PXO99A菌株的无毒基因突变体PXO99△avr进行Southern杂交验证、突变序列分析和致病性测定.结果表明:该突变体缺失了5个无毒基因,同源重组发生在PXO99A全基因组中一个有5个无毒基因串联的位点上;与PXO99A相比,突变体在IRBB10等15个水稻品种上引致的病斑明显缩短,而在IRBB14、IRBB21和IRBB55上的病斑则变长;缺失的5个无毒基因的综合表现为毒性因子功能.推断:在缺失的基因中含有无毒基因avrXa14、avrXa21、avrxa13以及与抗病基因Xa3、Xa4、xa5、Xa10、Xa17亲和互作有关的毒性因子. 相似文献
3.
水稻白叶枯病菌[Xanthomonas oryzaepv.oryzae(Ishiyama)Dye]是水稻上重要的细菌病害之一,探明无毒基因avrXa3和含不同抗病基因水稻品种间的互作对于制定有效的病害防治措施有着重要的意义。根据无毒基因avrXa3的序列,构建了水稻白叶枯PXO99A菌株缺失5个串联的无毒基因的突变体PXO99△avr。将avrXa3导入PXO99A和PXO99△avr后,得到衍生菌株PXO99A/avrXa3,PXO99△avr/avrXa3,与36个含不同抗病基因的水稻品种进行互作分析。结果显示,导入avrXa3后的菌株在不同的水稻品种上表现出明显的寄生适应性变化。进一步分析证明无毒基因avrXa3在Wase Aikoku 3、IRBB2、IRBB3、IRBB203、IRBB204、IRBB205、IRBB211、IRBB53、IR24、TN-1等11个水稻品种上病斑缩短,表现明显的无毒活性;在IRBB21、IRBB10、IRBB14、IR26、Cas209、Java14这6个品种上病斑明显变长,体现无毒基因的毒性功能。表明无毒基因avrXa3对PXO99A中其他无毒基因的表达有明显的干扰作用,单个效应分子的变化也会使细菌在不同水稻品种上的寄生适应性发生复杂的改变。 相似文献
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水稻条斑病菌和白叶枯病菌致病相关基因的敲除 总被引：1，自引：0，他引：1
wxocA、wxocB、wxocD、wxocE和wzt是水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv．oryzicola，Xooc）的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）合成基因，avrXa3是水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv．oryzae，Xoo）的一个无毒基因。利用pBCSK（-）和pKNG101两个质粒的复制起点不被水稻黄单胞菌识别的特点，把wxocA、wxoeD、wxocE和wzt的中心区域克隆在pBCSK（-）上，获得突变转化单元pBCSK：：ΔwxocA、pBCSK：：hwxocD、pBCSK：：AwxocE和pBCSK：：Δwzt。把wxocB和avrXa3基因的旁侧序列和一个氯霉素抗性基因cm构建在pKNG101上，获得突变转化单元pKNG101：：ΔwxocB和pKNG101：：Δavr。以电转化方式把这些LPS合成基因突变转化单元DNA转入Xooc菌株RS105，把无毒基因突变转化单元转入Xoo菌株PXO99，通过同源重组分别获得了RS105中5个如相应基因突变体MwxocA、MwxocB、MwxocD、MwxocE、Mwzt和一个无毒基因的突变体PX099Δavr。SDS-PAGE分析发现，lps突变体的O抗原或核心寡糖的合成被破坏。致病性分析结果显示，基因wxocB、woxocE和wzt与致病性有关，前两基因的突变导致细菌完全失去毒性，而后一基因的突变导致细菌部分丧失毒性。与PX099相比无毒基因突变体PX099Δavr改变了原有的毒性表型，在IRBB50（Xa4／xa5）和Asominori（Xa17）上由较感转变为较抗表型。因此，本试验证明，以pBCSK（-）和pKNG101为载体敲除水稻条斑病菌和白叶枯病菌致病相关基因是可行的。 相似文献
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水稻白叶枯病菌fkbM基因对其运动性的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]研究水稻白叶枯病菌fkb M基因对其运动性的影响。[方法]采用同源置换方法对水稻白叶枯病菌野生型菌株PXO99A的fkbM基因进行基因敲除,构建突变菌株ΔfkbM_(Xoo),同时构建互补菌株ΔfkbM_(Xoo)(C)。通过运动性试验,确定fkbM基因对运动性的影响。[结果]与野生型菌株PXO99~A相比,ΔfkbM_(Xoo)突变体运动性明显减弱,而互补菌株ΔfkbM_(Xoo)(C)能基本恢复水稻白叶枯病菌的运动性。[结论]水稻白叶枯病菌fkbM基因突变能减弱水稻白叶枯病菌的运动能力。 相似文献
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通过功能互补试验，从慢性型大豆根瘤菌USDA110菌株基因文库中筛选到能互补广宿主根瘤菌NGR234的bdhA突变体菌株NGRPA2和苜蓿根瘤菌的bdhA突变体菌株Rm11107，使之恢复Hbu^ 表型的克隆；经酶活测定的Southern杂交证明该克隆含有bdhA基因。测定了bdhA基因全序列，并在GenBank登记（登记号为：AY077581）。该基因由789个碱基对组成，编码分子量为27.59ku，含262个氨基酸残基的3-羟基丁酸脱氢酶，在该基因的开放阅读框内插入interposonΩKm，并通过同源重组构建了Bradyrhizobium japonicum bdhA突变体（bdhA::ΩKm)。植株试验未显示bdhA基因的突变对结瘤，固痰有明显影响。 相似文献
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通过功能互补试验 ,从慢生型大豆根瘤菌USDA110菌株基因文库中筛选到能互补广宿主根瘤菌NGR2 34的bdhA突变体菌株NGRPA2和苜蓿根瘤菌的bdhA突变体菌株Rm1110 7、使之恢复Hbu+ 表型的克隆 ;经酶活测定和Southern杂交证明该克隆含有bdhA基因。测定了bdhA基因全序列 ,并在GenBank登记 (登记号为 :AY0 775 81)。该基因由 789个碱基对组成 ,编码分子量为 2 7.5 9ku、含 2 6 2个氨基酸残基的 3 羟基丁酸脱氢酶。在该基因的开放阅读框内插入interposonΩKm ,并通过同源重组构建了BradyrhizobiumjaponicumbdhA突变体 (bdhA ::ΩKm)。植株试验未显示bdhA基因的突变对结瘤、固氮有明显影响。 相似文献
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根据水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)PXO99的tatB基因序列设计引物,采用PCR方法从PXO99中克隆了tatB基因,命名为tatBXoo。通过同源重组的方法,构建了tatBXoo的插入突变株TBM,在含有X-gluc的抗性平板上筛选,并经Southern blot杂交验证确认。表型测定结果表明:与野生型相比,tatB突变株在水稻(寄主)上的致病性减弱,但在烟草(非寄主)上仍具有引起过敏反应的能力;tatB突变导致Xoo致病相关的重要表型如胞外多糖减少,游动性及趋化性减弱。但是,tatB突变不影响Xoo在基本培养基(MMX)中正常生长、胞外纤维素酶产生和生物膜形成。 相似文献
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【目的】克隆植物内生解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BS2的β-1,4-内切葡聚糖酶基因（β-1,4-endoglucanase gene,eglS）,探明BS2中该基因与定殖的相关性。【方法】以枯草芽孢杆菌BS168基因组为模板扩增组成型启动子rpsD。依据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因的同源序列设计1对引物,以BS2基因组为模板扩增eglS。将rpsD启动子基因和eglS片段用T4连接酶连接,并对连接产物进行PCR扩增,得到eglS表达盒片段。将表达盒片段插入穿梭载体pGFP4412用以构建eglS过表达质粒。设计引物扩增eglS的同源重组片段,与具有单交换功能的整合载体pMUTIN-GFP+连接构建敲除质粒。eglS的过表达质粒和敲除质粒转化芽孢杆菌感受态细胞分别获得过表达突变体和敲除突变体。将过表达质粒转化敲除突变体感受态细胞获得互补突变体。采用荧光显微镜观察、PCR、平板酶活力检测及实时荧光定量PCR方法鉴定突变体。3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）测定突变体和野生菌的β-1,4-内切葡聚糖酶活力,同时采用定量灌根接种法检测不同菌株30 d内在小白菜各组织中的定殖数量。【结果】获得在荧光显微镜下呈现绿色荧光的过表达突变体和互补突变体。PCR检测结果表明敲除突变体中能够扩增出675 bp的目的条带,而以野生菌株和整合载体DNA为模板扩增时没有对应条带,成功得到敲除突变体。野生菌及各突变体β-1,4-内切葡聚糖酶平板活力检测结果显示,野生菌BS2只有一个水解圈且透明,过表达突变体与互补突变体有大于野生菌的双水解圈,内圈的水解圈透明,外圈的水解圈不透明。敲除突变体沿菌体边缘也有一个小水解圈。实时荧光定量PCR的分析结果证实野生菌及突变体间β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量存在差异,过表达突变体和互补突变体中β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量增高,分别是野生菌的111和82倍;敲除突变体中β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量相对于野生菌BS2几乎为0。突变体与野生菌在小白菜体内定殖数量以及酶活力检测结果表明,在相同的小白菜组织以及相同的分离时间内,敲除突变体的定殖数量最少,其在根茎叶中的定殖数量与其他菌株相比均有显著性差异（P＜0.05）。敲除突变体的酶活力也显著低于其他菌株（P＜0.05）。过表达突变体的酶活力以及在小白菜体内的定殖数量在P＜0.05水平上显著高于敲除突变体和野生菌,互补突变体的酶活力和在小白菜体内的定殖数量与过表达突变体基本一致。【结论】内生芽孢杆菌BS2菌株β-1,4-内切葡聚糖酶的活力高低与其在小白菜体内的定殖数量之间呈正相关关系,其表达的β-1,4-内切葡聚糖酶在定殖过程中发挥一定作用。 相似文献
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与马铃薯晚疫病菌无毒基因Avr1连锁的AFLP标记 总被引：11，自引：1，他引：11
以具有和不具有无毒基因Avr1表现型的马铃薯晚疫病菌株80029 (AVR1) 和88133 (avr1)以及其杂交F1代50个菌株群体为试材，限制性内切酶PstI和HhaI为酶切组合，采用荧光AFLP技术和混合分组分析法(BSA)，通过256对引物筛选得到了5个与Avr1连锁的候选AFLP标记并进行了菌株个体验证，遗传分析表明5个标记中有2个标记与Avr1连锁且在F1代中共分离，无交换重组发生。 相似文献
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通过筛选稻瘟菌(Magnaporthe grisea)P131小种的REMI(Restriction enzyme mediated integration)转化体库,获得1株对水稻品种爱知旭品种特异性改变的突变体MS220。Southern及质粒拯救分析表明:外源质粒在基因组中的整合为单位点、双拷贝反向串联插入。以质粒拯救所获得的侧端序列为探针,通过对爱知旭的毒性菌株和无毒菌株在插入位点处的RFLP分析,结果表明:两者在SacI酶切的泳道内出现了明显的多态性,由此推测,控制野生型菌株P131的无毒相关基因,由于外源质粒插入而发生突变。因此,可以以此为标记,克隆控制该表型的基因。 相似文献
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[目的]构建假单胞菌毒性基因(oprD)缺失突变株,为进一步探讨其编码的毒力因子功能奠定基础。[方法]利用pEX18Gm质粒作为基因敲除的载体,构建假单胞菌oprD基因重组自杀质粒,通过同源重组并激活自杀基因方式,筛选到目的基因缺失的突变株,再利用pBBR1MCS-2质粒作为目的基因回补的载体,构建回补载体。[结果]同源重组后,经过庆大霉素和氯霉素双抗平板、蔗糖平板筛选和PCR鉴定,成功获得了oprD基因缺失突变株,类似操作获得了回补菌株。[结论]基因缺失突变株的成功构建可为下一步的毒性机理研究奠定基础。 相似文献
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采用Red重组技术,将大肠杆菌K12的dapA基因置换,构建dapA基因缺失的突变株,通过发酵测定突变株L-苏氨酸的产量.获得的dapA基因缺失突变株命名为K12△dapA.结果表明:在相同培养条件下发酵48 h,重组菌株K12△dapA发酵液中积累的L-苏氨酸达3.71 g/L,是Ecoli K12原始菌株的3倍.d... 相似文献
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大丽轮枝菌VdLac基因克隆与功能分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为探讨漆酶基因VdLac在大丽轮枝菌中的功能,克隆该基因并利用农杆菌介导的遗传转化方法和PEG介导的原生质体转化方法对VdLac进行敲除和功能回复,获得敲除和互补突变体。以野生型JY为对照,对敲除突变体和互补突变体进行生物学功能测定。结果显示,VdLac基因全长1 978bp,cDNA序列全长1 713bp,编码570个氨基酸组成的蛋白质;VdLac基因缺失突变体(△VdLac)对硝化压力更敏感,其在CM培养基上仍可产生漆酶,但产生漆酶的能力降低;表明大丽轮枝菌漆酶基因VdLac不影响菌株的营养生长、产孢、致病力以及黑色素合成。 相似文献
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构建了ura3缺失基因载体pEMT-△ura3,采用农杆菌介导法转化里氏木霉QM9414,在含尿嘧啶核苷(1.87 mg.mL-1)和五氟乳氰酸(5-FOA,5 mg.mL-1)的筛选培养基上筛选转化子,经表型验证和PCR检测,获得ura3基因缺失突变体1株,ura3基因的同源重组率为16.6%。采用农杆菌介导法将黑曲霉的pyrA基因导入ura3基因缺失突变体中,使其回复野生型表型,从而建立了以pyrA基因作为筛选标记的里氏木霉受体菌株。 相似文献
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【目的】水稻黄单胞水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae, 简称Xoo）侵染引起水稻白叶枯病,在侵染过程中Xoo可产生胞外多糖(EPS)、胞外酶、黏附因子、T3SS以及其产生的效应因子等毒性因子。细菌第二信使环鸟苷二磷酸（c-di-GMP）的水平在Xoo毒性调控中发挥了重要的作用,而PXO_02944是包含REC、GGDEF和EAL结构域的蛋白,是c-di-GMP信号蛋白家族的成员,研究旨在阐明水稻白叶枯病菌的环鸟苷二磷酸信号蛋白家族成员PXO_02944的基因结构和功能。【方法】根据PXO_02944基因序列信息,以PXO99A基因组DNA为模板,设计引物扩增PXO_02944基因全长,将其GGDEF结构域和EAL结构域分别与已经报道的保守的GGDEF结构域或EAL结构域蛋白进行氨基酸序列比对分析;分别扩增PXO_02944左右臂片段,将其与目的载体pK18mobsacB载体连接,得到质粒pK2944,将pK2944与pMD-GmR载体回收获得的GmR基因片段进行连接,获得重组质粒pK2944-GmR,用于构建基因突变体。将PXO_02944全长基因克隆到载体pHM1上,获得重组质粒pHM1-2944并转化到ΔPXO_02944中,即获得互补菌株ΔPXO_02944::C。对野生型菌株、突变体和互补菌株进行表型测定,分析PXO_02944 基因缺失突变对Xoo致病性和EPS产生、生物膜形成、胞外酶活性和鞭毛运动性的影响,并通过qRT-PCR方法测定EPS合成基因和毒性相关基因的表达。【结果】用特异性引物进行PCR扩增,成功地从野生型菌株PXO99A中克隆了PXO_02944;生物信息学分析发现,PXO_02944蛋白具有磷酸化信号接收的REC输入结构域和GGDEF、EAL输出结构域,但GGDEF和EAL结构域保守序列发生了突变。与野生型菌株PXO99A相比,虽然PXO_02944突变体胞外纤维素酶和木聚糖酶活性、鞭毛运动性都无明显变化, 但其对水稻的致病性、EPS产生和生物膜形成能力显著增强,T3SS调控基因hrpG和EPS合成基因gumG的转录水平也明显升高。【结论】应答调控因子PXO_02944负调控了水稻白叶枯病菌致病性、EPS产生和生物膜形成这些毒性因子的表达。 相似文献
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[目的]用分子改造的方法改造里氏木霉(Trichoderma reesei的纤维二糖水解酶基因cbh1,提高其纤维素酶活力,为工业化生产纤维素酶提供参考.[方法]用DNaseI消化里氏木霉cbh1,回收100 bp左右的片段后用T4 DNA连接酶连接,以连接产物作为模板进行PCR扩增,将PCR改造的cbh1基因转化里氏木霉原生质体,使改造的cbh1基因与里氏木霉原有的cbh1基因发生同源重组.通过比较滤纸酶活力的方法筛选纤维素酶活力提高的突变菌株,在NCBI上比对分析突变菌株的cbh1序列.[结果]经克隆测序获得基因片段大小为637 bp,与里氏木霉同属菌株cbh1基因的相似性在88‰98％,确定为里氏木霉cbh1的基因片段.经DNaseI消化15 min、T4 DNA连接酶连接、经PCR扩增获得改造后的cbh1基因.将改造cbh1基因片段转化里氏木霉原生质体,得到cbh1基因突变体库.从cbh1基因突变体库中筛选获得1株纤维素酶滤纸酶活比出发菌株高1.7518倍的突变菌株E2-1.序列比对分析发现,与出发菌株相比,突变菌株E2-1的cbh1基因有14个碱基发生了突变,其中5个碱基为置换突变,8个碱基为缺失突变,1个碱基为插入突变,分布于cbh1基因的9个位置.[结论]改造后的cbhl因能与里氏木霉的染色体DNA发生同源重组,进而提高突变菌株的纤维素滤纸酶活力. 相似文献