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鸡胚成纤维细胞cDNA T7噬菌体表达文库的构建和鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
构建鸡胚成纤维细胞(CEF)T7噬菌体表达型cDNA文库,为筛选和研究CEF上病毒受体分子奠定基础。提取纯化CEF的mRNA,反转录合成双链cDNA,补平末端,连接EcoRⅠ/HindⅢ接头,双酶切,凝胶过滤层析除去小于400bp的cDNA片段,合成双链cDNA定向与T7噬菌体左右臂连接,体外包装后建成cDNA表达文库。测定文库大小、重组率,并以PCR鉴定cDNA插入片段的大小。结果表明,构建的cDNA文库滴度为2.2×107pfu/mL、扩增后滴度为3.5×1010pfu/mL,重组效率达98%、插入片段多在0.4～3kb之间,平均插入片段长约1.3kb。表明所建文库具有很高的质量,从而为筛选目的cDNA克隆奠定了基础。 相似文献
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用植物(叶)总RNA抽提试剂盒提取彩叶草红色品种顶部叶片总RNA,用SMARTcDNALi-braryConstructionKit构建cDNA文库。经测定原始文库滴度为1.2×106pfu/ml,扩增总文库滴度为6.7×109pfu/ml,重组率达到98%,插入片段在0.5kb到2kb之间,1kb以上的占60%。通过PCR检测,从总文库中检测到了彩叶草CHS、DFR及ANS基因的特异片段。各项指标都表明,已获得较高质量的cDNA文库,为彩叶草叶色基因的分离克隆,彩叶草类黄酮类色素合成的分子调控的研究奠定了基础。 相似文献
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通过CAP-trapper法构建台湾乳白蚁的中后肠全长cDNA文库,经过中后肠总RNA的提取、mRNA的纯化与分离、cDNA双链的合成、cDNA大片段的分级分离与回收、载体的连接,体外包装等步骤,获得了滴度为1.6×106pfu/mL,重组率为98.7%,库容量为5.6×107cfu的初级文库,扩增后文库滴度为8.5×109pfu/mL,插入片段平均大小为2.1 kb,插入片段全长率约为44%。这表明利用该方法构建台湾乳白蚁中后肠cDNA文库切实可行。 相似文献
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采用沙门氏菌以针刺法诱导家蝇三日龄幼虫,提取诱导后培养24 h的家蝇幼虫总RNA,进一步分离、纯化其mRNA,运用SMART技术构建家蝇幼虫cDNA文库.结果表明:原始文库的滴度为1.55 × 106 pfu/mL,原始文库重组宰为99.5%,文库扩增后滴度达1.27 × 10 pfu/mL.从扩增文库随机挑取10个噬菌斑克隆进行PCR扩增鉴定,结果显示所选的lO个噬菌体克隆均合有重组的cDNA,插入片段大小为400～1 500 bp. 相似文献
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用Stratagene技术构建了吉富品系尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)肝cDNA文库。首先用TRIZOL法提取肝总RNA,经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测,表明总RNA纯度高且完整性良好。然后分离纯化mRNA,合成双链cDNA之后,加EcoRⅠ接头、EcoRⅠ末端磷酸化、XhoⅠ消化,并用葡聚糖凝胶柱层析分级收集cDNA样品,得到300 mg cDNA,符合建库要求。双链cDNA与Uni-ZAP XR Vector连接后,用GigapackⅢGold Packaging Extract进行体外包装得到cDNA文库。测得的文库滴度为1.25×107pfu/mL,文库噬菌体的滴度符合文库保存和筛选实验的要求。随机挑选20个阳性单克隆噬菌斑进行PCR鉴定后,得出文库的重组率达100%,扩增出的片段主要集中在0.5~2 kb之间,平均插入片段长度约为1.05 kb,结果说明本实验所构建的cDNA文库质量较高。取扩增文库80μL进行体外切割,约含3.6×106个重组子,切割后phagemid量为2.0×106,切割效率为79.4%。经抽提质粒获得质粒DNA约1.2 mg。 相似文献
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SMART策略构建小黑杨茎形成层全长cDNA文库 总被引：2，自引：0，他引：2
为了研究小黑杨木材形成过程中的关键基因,以2年生小黑杨茎形成层组织为试验材料提取RNA,采用SMART(RNA转录过程中的5′末端转换机制)技术合成cDNA第一链,通过LD-PCR合成双链cDNA。利用SfiⅠ限制性酶酶切后将其连接到质粒载体pDNR-LIB上,采用电穿孔法将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中,构建全长cDNA文库。文库质量鉴定表明:原始文库滴度为2.18×106pfu/mL,扩增后的文库滴度为5.46×109pfu/mL,重组率为96%。插入片段长度在0.5～2.0kb之间,平均长度为1.12kb,表明构建的小黑杨茎形成层cDNA文库较为理想。 相似文献
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缺刻缘绿藻（Myrmecia incise）富含花生四烯酸（arachidonic acid,AA）,是迄今为止所知道的花生四烯酸含量最高的藻类。采用Trizol法提取总RNA,然后按照Clontech公司的SMART cDNA文库构建的方法,构建了缺刻缘绿藻的cDNA文库,测得的原始文库滴度为6×10^6pfu／mL,随机挑选文库的阳性单克隆进行PCR鉴定,扩增出的片段主要集中在0．5-1．5kb,平均插入片段长度约为1kb,文库的重组率达95．83％,说明本实验所构建的cDNA文库质量合格。 相似文献
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缺刻缘绿藻（Myrmecia incise）富含花生四烯酸（arachidonic acid,AA）,是迄今为止所知道的花生四烯酸含量最高的藻类。采用Trizol法提取总RNA,然后按照Clontech公司的SMART cDNA文库构建的方法,构建了缺刻缘绿藻的cDNA文库,测得的原始文库滴度为6×10^6pfu／mL,随机挑选文库的阳性单克隆进行PCR鉴定,扩增出的片段主要集中在0．5-1．5kb,平均插入片段长度约为1kb,文库的重组率达95．83％,说明本实验所构建的cDNA文库质量合格。 相似文献
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[目的]以长白山区鸡爪苓菌丝为材料,通过SMART技术构建全长cDNA文库.[方法]采用Trizol reagent试剂盒提取菌丝体总RNA,通过LD-PCR反转录合成双链cDNA,连接至载体λTriplEx2,构建鸡爪苓菌丝体全长cDNA文库.[结果]经测定,原始文库的滴度为1.66×106 pfu/ml,重组率为96.97％,扩增文库的滴度为1.504×1010pfu/ml,插入片段主要分布于500～2000 bp.[结论]成功构建了鸡爪苓菌丝cDNA,为鸡爪苓生长分化的分子机制研究提供理论基础. 相似文献
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策略构建小黑杨茎形成层全长cDNA文库 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研究小黑杨木材形成过程中的关键基因,以2年生小黑杨茎形成层组织为试验材料提取RNA,采用SMART (RNA 转录过程中的5′末端转换机制) 技术合成cDNA第一链,通过LD-PCR合成双链cDNA。利用SfiⅠ限制性酶酶切后将其连接到质粒载体pDNR-LIB上,采用电穿孔法将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中,构建全长cDNA文库。文库质量鉴定表明:原始文库滴度为2.18×106 pfu/mL,扩增后的文库滴度为5.46×109 pfu/mL,重组率为96%。插入片段长度在0.5～2.0 kb之间,平均长度为1.12 kb,表明构建的小黑杨茎形成层cDNA文库较为理想。 相似文献
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体外特异位点重组技术应用于cDNA文库的构建,克服了传统文库构建方法中的常见问题。本研究利用这一技术,以能够分离得到植物激活蛋白的黄瓜灰霉菌(B.cinerea)菌株为材料,用TRIZOL试剂提取总RNA,从中分离纯化出mRNA,用预先接有attB2位点的Oligo(dT)引物和SuperScriptTMⅡ反转录酶合成cDNA,双链cDNA与attB1接头连接,经重组、转化后构建了其cDNA文库。文库滴度为2.3×106pfu/mL,文库总容量达2.53×107。随机挑取24个克隆,经酶切检测,平均插入片断为1466bp,重组率达100%。 相似文献
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紫外线辐射的葡萄幼果cDNA文库的构建 总被引：2，自引：2，他引：2
以紫外线辐射的葡萄幼果为材料提取总RNA,用SMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建cDNA文库,初始文库含有1.5×106个独立的单克隆,扩增后滴度达到1.2×108pfu.mL-1.随机挑取噬菌斑进行PCR检测,发现重组率在92.9%以上. 相似文献
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福州地区小菜蛾全长cDNA文库构建与分析 总被引：1，自引：1，他引：0
采用ZAP Express cDNA Gigapack Ⅲ Gold Cloning Kit试剂盒,构建了小菜蛾(Plutella xylostella)的全长cDNA文库.利用TRIzol试剂盒提取小菜蛾成虫总mRNA,通过Oligo试剂将mRNA反转录成cDNA,再以第一链cDNA产物为模板合成第二链cDNA,该cDNA产物经分级分离和体外包装,即获得小菜蛾cDNA原始文库,其滴度为1.5×106pfu.mL-1.扩增后的cDNA文库的滴度为1.4×1010pfu.mL-1.取适量扩增文库稀释并铺平板,挑取20-25个独立噬菌斑,用M13±通用引物PCR扩增后,测得文库的重组率大于95%,插入cDNA片段的长度平均为1.25 kb.该文库的构建,可为小菜蛾抗药性基因的相关研究提供一个平台. 相似文献
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【目的】为了解大豆多荚、多粒相关基因的调控机制,构建了大豆花芽cDNA文库,根据要求初步鉴定了所构建文库的质量.【方法】以大豆吉农18突变体的幼嫩花芽为材料提取总RNA,采用SMART技术合成双链cDNA.经蛋白酶K的消化及SfiⅠ酶切后,将所得cDNA克隆到λTriplEx质粒载体中,成功构建了大豆花芽全长cDNA文库.【结果和结论】将初始文库经扩增后保存,检测扩增文库滴度为2.13×108pfu/mL,重组率接近95.3%,菌落PCR鉴定插入片段主要分布在0.5~2.0 kb.插入片段平均大小在1.0 kb左右.表明本研究所构建的文库既满足了目的基因的分离筛选,又可保证全长cDNA文库的获得,该文库的构建为进一步开展相关基因的克隆及分子生物学研究奠定基础. 相似文献
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盐胁迫下短芒大麦cDNA文库的构建 总被引：2，自引：1，他引：2
为了克隆与研究盐胁迫相关的基因,以盐胁迫后的短芒大麦叶片为材料,用Trizol一步法提取总RNA。Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA。反转录合成第一链cDNA和第二链cDNA。cDNA纯化后,与λZAP表达载体连接,体外包装后得到盐胁迫下短芒大麦cDNA文库,其重组率达96％,滴度为2×10~7pfu/mL,插入片段长度0.5～3.0kb。 相似文献