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为高效表达几丁质酶基因tachi1,研究Tachi1的酶学性质。采用PCR技术从棘孢木霉中克隆了几丁质酶基因tachi1并与pEHisTEV原核表达载体融合,转化大肠杆菌BL21。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得了以包涵体形式高效表达的Tachi1。包涵体经洗涤、溶解、复性和纯化后获得了高纯度的Tachi1。复性后的Tachi1具有较高的几丁质酶活性,该几丁质酶反应的最适温度为50℃,最适pH 5.5。几丁质酶在30~35℃下稳定,在pH 3~7之间几丁质酶有较高活性。 相似文献
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十字花科植物广泛存在芥子酶,并利用芥子酶以抵御病虫害的侵袭。TGG4和TGG5是在拟南芥中发现的新型芥子酶基因,二者基因序列极为相近。本试验通过对转TGG4和TGG5基因酵母的诱导表达及相应重组蛋白的纯化,探讨两个蛋白的酶学差异性。结果表明:TGG4、TGG5的最大Vc激发浓度都为1mmol/L;但是在最适反应温度和最适反应pH上,两个重组蛋白略有不同,TGG4和TGG5的最适温度分别为67℃和57℃,而最适pH分别为6.5和5.5,TGG4比TGG5要耐高温耐碱性;这两个重组蛋白酶活性都受NaCl的抑制。 相似文献
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为找到理想的工业化生产海藻糖合成酶基因工程菌,以长白山温泉SH-110基因组DNA为模板,PCR扩增编码Tres基因片段,克隆至pET-30a(+)原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3),实验中采用IPTG和乳糖同时进行对比诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和酶学性质研究。成功克隆了2912 bp的Tres基因,实验中发现加入IPTG和乳糖后,融合蛋白在胞内都得到了表达,而且添加乳糖诱导的蛋白表达量偏高。表达重组酶Tres相对分子量约为110 kDa,最适作用温度60℃,最适pH7.0。金属离子Ca2+、K+、Zn2+对重组酶有明显激活作用,Ba2+、Cu2+、Mn2+有明显抑制酶活作用。重组酶的动力学常数Km为8.823 mmol/L和Vmax为235.29 mmol/L。已成功在大肠杆菌表达重组Tres,为进一步研究利用基因工程菌生产大量海藻糖合成酶,进行大规模生产海藻糖提供理论依据。 相似文献
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香蕉内生拮抗细菌KKWB-5的几丁质酶在大肠杆菌中的表达纯化与复性研究 总被引：1，自引：1，他引：0
将香蕉内生拮抗细菌KKWB-5的几丁质酶在大肠杆菌中的表达,旨在检测该酶对香蕉枯萎病病原菌4号小种的抗性。PCR扩增该基因连入大肠杆菌表达载体pET22b,导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组菌株,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达,对目的蛋白进行纯化,并将纯化后的目的蛋白复性,对复性产物进行水解几丁质活性和拮抗香蕉枯萎病活性的分析。SDS-PAGE分析表明目的蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式大量表达,经变性Ni2+柱纯化得到了高纯度的重组蛋白,表达量达293 mg/L;稀释和透析两种复性方法中,透析复性法的目的蛋白得率较高,为84.6 %。复性后的目的蛋白具有水解几丁质的活性,同时对香蕉枯萎病病原菌也具有一定的抗性,但抗性较弱。该几丁质酶在大肠杆菌中得到高效表达,且复性后的几丁质酶对香蕉枯萎病病原菌4号小种有一定的抑制作用,该酶对KKWB-5菌株拮抗香蕉枯萎病菌的能力有一定的贡献。 相似文献
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拟南芥硫代葡糖苷酶基因TGG1的克隆、表达和酶学特性 总被引：2，自引：2，他引：0
本研究克隆拟南芥硫代葡糖苷酶基因TGG1,利用毕氏酵母表达。重组蛋白用镍亲和柱纯化,获得高纯度芥子酶。重组蛋白分子量78 kD,与天然TGG1分子量接近,为糖基化蛋白。TGG1信号肽在酵母中具有分泌功能,约25%芥子酶分泌到培养基中。TGG1重组蛋白具有广泛的pH适应性,最适反应温度40℃左右。其活性被低浓度维生素C激活,被高浓度维生素C抑制。用Hanes plot方法计算TGG1重组蛋白以Sinigrin为底物时,Km为65μmol/L,最大反应速率Vmax=3.28μmol.min-1.mg-1。 相似文献
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亚麻仁苷酶(Linamarase)是存在于木薯、巴豆等作物中的降解生氰葡萄糖苷Linamarin（亚麻仁苷）的酶,在结构上与芥子酶有很大的相似性,对它的研究有利于揭示生氰葡萄糖苷酶和芥子酶之间的关系以及芥子酶的起源问题。通过真核表达的方法,克隆了木薯Linamarase基因,构建酵母表达载体,转化毕赤酵母GS115,经诱导表达和亲和纯化,获得纯化的Linamarase重组蛋白。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量集中在71 kD左右。该酶最适反应温度在37℃左右,最适pH约为5。以pNPG为底物时,Km为1.70 mmol/L,最大反应速率Vmax为8.36 μmol/(min?mg)。 相似文献
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多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是一种特异性结合和抑制真菌内切多聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)活性的细胞壁结合蛋白。采用RT-PCR从嘉陵40(Morus atropurpurea Roxb.)果实中扩增PGIP基因c DNA,利用生物信息学的方法分析其编码蛋白的结构和功能。结果表明,嘉陵40PGIP开放阅读框全长1017 bp,编码338个氨基酸残基,被命名为MaPGIP1。MaPGIP1蛋白分子量37.9 k D,等电点为为6.65,信号肽为N端26个氨基酸残基,具有4个潜在的N-糖基化位点。MaPGIP1蛋白的核心区域由9个串联的LRRs基序组成。原核表达产物经SDS-PAGE分析,MaPGIP1蛋白以包涵体形式出现,Western blot证实了重组蛋白的特异性,经过Ni-NTA柱纯化和分步透析复性后获得可溶性蛋白,该蛋白能部分抑制果桑肥大性菌核病菌(Ciboria shiraiana)PG(Cs PG)活性,其最适pH值为4.5~5.0,最适温度30℃。抑菌试验结果表明,MaPGIP1蛋白在果桑肥大性菌核病菌菌丝侵染油菜叶片过程中具有一定的抑制效果。 相似文献
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转CrylAC及CrylAC+CpTI基因对棉花上绿盲蝽2种消化酶活性及海藻糖含量的影响 总被引：2，自引：2，他引：0
以转基因棉国抗22,sGK321及其亲本棉泗棉3号、石远321为材料,研究了上述4种寄主上绿盲蝽淀粉酶、蛋白酶活性及海藻糖含量。结果表明：与亲本棉相比,2种转基因棉绿盲蝽若、成虫淀粉酶、蛋白酶活性和海藻糖含量均值较高,且若虫淀粉酶活性、成虫海藻糖含量在转基因棉国抗22和其亲本棉泗棉3号之间差异显著;同一品种棉花上成虫的淀粉酶、蛋白酶活性和海藻糖含量均高于若虫,并差异极显著。绿盲蝽若、成虫淀粉酶、蛋白酶活性及海藻糖含量在转基因棉及其亲本棉上的频率分布高峰基本一致;但与亲本棉花相比,2种转基因棉所测指标在低区间段分布较少,在高区间段分布较多。 相似文献
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绿盲蝽热激蛋白90基因AlHSP90是绿盲蝽体内重要的抗逆基因,参与绿盲蝽耐受高温、杀虫剂等胁迫反应。为了明晰绿盲蝽取食不同寄主植物后其体内抗逆基因的表达特征,本试验通过荧光定量PCR和Western杂交技术,重点分析AlHSP90基因及其蛋白在绿盲蝽取食不同寄主植物后的表达谱。结果表明:绿盲蝽雌、雄成虫取食Bt棉、常规棉后,AlHSP90表达量显著高于取食其他寄主植物(P0.01);与对照四季豆相比,取食茼蒿之后AlHSP90表达量无显著变化(P0.05)。雌成虫取食Bt棉、常规棉后,AlHSP90表达量分别比对照上升了1.77、1.74倍;而雄成虫取食Bt棉、常规棉后,AlHSP90表达量则分别比对照上升了1.98、1.94倍。取食不同寄主植物之后,AlHSP90蛋白的表达谱结果与其基因的表达谱结果高度相似。绿盲蝽雌、雄成虫取食Bt棉、常规棉后,AlHSP90蛋白表达量显著高于取食其他寄主植物(P0.01);而取食茼蒿之后,AlHSP90蛋白表达量无显著变化(P0.05)。由此可见,AlHSP90基因是绿盲蝽适应棉花取食过程中重要的抗逆基因,并在绿盲蝽寄主转换过程中起到重要作用。 相似文献
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果桑肥大性菌核病菌多聚半乳糖醛酸酶基因(CsPG1)的克隆及功能分析 总被引：1，自引：0，他引：1
多聚半乳糖醛酸酶(Polygalactuionasem, PG)是一种细胞壁结构蛋白,可以催化果胶分子多聚α-(1,4)-聚半乳糖醛酸的裂解,使细胞壁结构解体,导致果实软化。本文采用qRT-PCR方法,分析不同生长阶段菌丝侵染的油菜叶片中多聚半乳糖醛酸酶基因的表达模式。结果表明：(1)采用RT-PCR从果桑肥大性菌核病菌(Ciboria shiraiana)菌核中扩增多聚半乳糖醛酸酶基因cDNA,其全长为1143 bp,命名为CsPG1 (GenBank登录号为KR296662),编码380个氨基酸残,根据侵染油菜叶片的表达量,确认CsPG为基因家族的主效基因;(2)将CsPG1基因连接pET28a(+)载体并转化大肠杆菌E. coli BL21 (DE3),获得包涵体形式,但对底物(聚半乳糖醛酸)没有活性的蛋白;(3)最适CsPG1包涵体溶解的尿素浓度6 mol L–1,采用缓慢稀释低温复性的方法对重组蛋白CsPG1进行了重折叠复性试验,经高亲和力的Ni-NTA树脂纯化后为得到单一条带,获得可溶性蛋白,复性后的多聚半乳糖醛酸酶比活力为5.02 U mg–1;(4)生物试验表明,CsPG1蛋白能够加速嘉陵40 (Morus atropurpurea Roxb.)桑椹的成熟和软化,推测该蛋白与肥大性菌核病菌对桑椹的侵染有关。这一结果揭示了不同果桑品种对菌核病敏感性的差异,为果桑生产中菌核病的防控提供了分子证据. 相似文献
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As an important digestive enzyme gene, the serine protease gene AlSP 3 plays a key role in Apolygus lucorum for digesting conventional cotton. To understand the effect of different temperatures on the expression level of AlSP 3, we analyzed the expression patterns of AlSP 3 in A. lucorum reared at different temperatures using real-time polymerase chain reaction. The results showed that at the normal temperature of 24 ℃, the expression of AlSP 3 in A .lucorum at different nymphal stages was similar. The expressions of AlSP 3 in the female adult at the pre-mating stage and the male adult at post-mating stage were 19.71- and 7.16-fold higher than their control at the 1st nymphal stage, respectively, which were significantly higher than at any other stages. However, expression in the 4th to 5th A. lucorum at the nymphal stage increased with rising temperature in the range of 21～30 ℃. At 30 ℃, the expression of AlSP 3 in the 2nd to 5th A. lucorum was the highest. The expression levels of AlSP 3 in adult A. lucorum reared at different temperatures during the new emergence and pre-mating stages were significantly higher than that of the control reared at 24 ℃ (P < 0.01), while the expression during the post-mating stage at 18℃ was higher than that at other temperatures. When incubated at extreme temperatures (4 ℃ and 40 ℃), the expression of AlSP 3 in female and male adult A. lucorum was significantly higher than that at 24 ℃ (P < 0.01). Taken together, our results showed that the external environment temperature and the internal stage of A. lucorum or its sex all had significant effects on the expression of AlSP 3 in A. lucorum (P < 0.01), and that there was some interactions between them. Therefore, AlSP 3 is very important for the female adult A. lucorum to obtain nutrition at the early stages and temperature is an important limiting factor for the expression of AlSP 3. 相似文献
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为了进一步研究BvGST基因(LOC104898671)在能源甜菜耐受重金属镉逆境胁迫过程中的功能，明确其在细胞解毒镉离子中的作用和应答特性，本研究以780016B/12优为植物材料，通过RT-PCR的方法将BvGST基因克隆并构建于大肠杆菌原核表达载体pEASY-Blunt E1上，并转化到大肠杆菌BL21中。SDS-PAGE电泳表明，通过1 mmol/L IPTG诱导，在重组菌BL21总蛋白的25.9 kDa左右的位置上，获得了大肠杆菌his tag-BvGST的融合蛋白。当施加0.5 mmol/L CdCl2逆境胁迫后，表达BvGST蛋白的重组菌表现出优于对照菌的生长状态；与此同时，大量表达BvGST的大肠杆菌体内的GST酶活性也要远高于对照。这说明，能源甜菜BvGST基因通过在E. coli体内大量表达高活性的谷胱甘肽转移酶，来解毒细胞内由镉胁迫带来的氧化伤害，从而提高大肠杆菌的Cd耐受性。研究结果暗示了能源甜菜BvGST在镉逆境胁迫分子机制中发挥着重要作用。 相似文献
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A型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
文章旨在利用原核表达系统表达并纯化出A型口蹄疫病毒VP1蛋白。首先从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT-PCR获得cDNA。并根据FMDV全基因组序列设计了一对针对VP1基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP1并亚克隆入pMD 18-T载体。将鉴定出的阳性质粒和表达载体PET32a用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切回收后连接获得阳性重组质粒PET32-VP1。用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP1并用SDS-PAGE进行检测。表达产物用镍亲和树脂进行了纯化。结果证明A型口蹄疫病毒VP1蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步的研究提供了重要的材料。 相似文献
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绿盲蝽分龄与其形态发育指标的相关性 总被引：1，自引：0，他引：1
昆虫龄数和龄期的确定是害虫预测预报以及制定其科学治理策略的重要依据,为了掌握绿盲蝽虫龄与其生长发育的关系,通过测微尺对绿盲蝽3项形态指标进行了测量,以期探明其形态发育特征,选择最佳的分龄指标.研究结果表明:依据形态指标的增长规律,绿盲蝽形态发育过程划分为速增期、缓慢期和停滞期3个时期;相邻龄期间头宽变幅的重叠度最低,变异系数小于体长和体宽;绿盲蝽形态发育特征不符合Dyar和Crosby法则.对所测3项形态指标和龄数进行线性和指数回归分析,结果表明指数模型决定系数均较小,拟合程度较差;3项指标与龄数间的线性拟合的决定系数均较大,其中以绿盲蝽头壳宽值与龄数的二次、三次线性决定系数最大(R2=0.961),直线决定系数为R2=0.942,体长和体宽的直线决定系数均为R2=0.940.因此,可以根据绿盲蝽头宽来识别其龄数,为准确识别绿盲蝽虫龄提供依据. 相似文献
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不同光周期对绿盲蝽实验种群生命表参数的影响 总被引：3，自引：0，他引：3
为探明光周期对绿盲蝽种群增殖的影响,应用种群生命表的方法（温度（25±1）℃、相对湿度（70±5）%、光照强度4000 lx）,系统研究了绿盲蝽(Apolygus lucorum Meyer-Dür )在5个光周期L︰D=8︰16,10∶14,12︰12, 14︰10和16︰8下的实验种群的生长发育特性和繁殖能力。结果表明,不同光周期处理下绿盲蝽各虫态存活率、产卵前期及产卵量等均有显著性差异。不同光周期处理下,绿盲蝽最高孵化率（L︰D=10︰14）比最低孵化率（L︰D=16︰8）高25.06个百分点;若虫最高存活率（L︰D=8︰16）比最低存活率（L︰D=16︰8）高25.26个百分点;雌成虫最高平均产卵量（L︰D=12︰12）比最低平均产卵量（L︰D=8︰16）多27.29粒。综合来看,光周期L︰D=12︰12处理下的绿盲蝽种群内禀增长率(rm)最大（0.1093）,种群加倍时间（DT）最短（6.3417）,表明该光周期处理十分有利于绿盲蝽种群的发育与繁殖。 相似文献
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为解决绿盲蝽严重为害春茶、防治指标空缺的问题,根据田间绿盲蝽若虫为害特征,对若虫的田间计数方法进行研究;利用田间试验,测算在不同绿盲蝽虫口密度下,茶鲜叶的经济损失率,并结合日照茶区绿盲蝽防治费用和茶鲜叶收益分析,确定日照茶区以虫口密度为测度的绿盲蝽防治指标。结果表明,绿盲蝽在茶丛的活动范围,受到鲜叶密度的影响。鲜叶密度大的茶园,一般在小范围内取食;鲜叶密度小的茶园,在略大的范围内取食。但是无论哪种茶园,其取食活动的茶丛横向范围都在一个不超过直径70cm的圆内。采摘单芽的区域,绿盲蝽防治指标应为0.99头/千梢;采摘一芽一叶的区域,绿盲蝽防治指标应为1.08头/千梢;采摘一芽一二叶的区域,绿盲蝽防治指标应为1.48头/千梢。以田间绿盲蝽虫口密度为测度的防治指标,具有很高的准确性,为防治费用和茶鲜叶收益与日照类似的茶园提供了科学依据,但由于绿盲蝽若虫田间一般呈聚集分布,且刚孵化若虫虫体较小,而且生活较隐蔽,不易被发现,应采取多次观察计数的方法,确定虫口密度。 相似文献