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1.
【目的】探究抗氧化剂-水溶性维生素E的类似物（Trolox）通过调控活性氧对猪肌肉干细胞增殖及分化过程产生的影响,为进一步优化培养肉种子细胞在体外增殖及分化过程提供研究基础。【方法】首先在猪肌肉干细胞增殖过程中,添加不同浓度（0、50、100和200 μmol∙L-1）的Trolox培养3 d,利用血细胞计数板进行细胞计数,统计细胞增殖倍数,同时利用CCK8技术检测不同浓度的Trolox对细胞增殖的影响;利用RT-qPCR技术检测不同浓度Trolox处理后表征干性的PAX7表达水平,Western Blotting技术检测PAX7蛋白的表达水平;通过CellROX荧光染料对细胞内活性氧进行染色并通过高通量高内涵活细胞共聚焦成像系统检测Trolox对活性氧的调控作用;进一步在猪肌肉干细胞体外成肌分化进程中添加Trolox处理,利用RT-qPCR技术检测分化早期标志基因MYOG、CAV-3及终末分化标志基因肌球蛋白重链（MyHC）的表达水平,并利用Western Blotting技术检测MyHC蛋白的表达,利用免疫荧光技术对MyHC进行染色并统计MyHC阳性细胞比例。【结果】细胞增殖倍数统计显示,50和100 μmol∙L-1的Trolox处理组猪肌肉干细胞增殖倍数显著高于对照组（P<0.05）;CCK8测得50和100 μmol∙L-1 Trolox处理组第3天的吸光值显著高于对照组（P<0.05）;100和200 μmol∙L-1的Trolox显著上调了PAX7的表达（P<0.05）,对PAX7蛋白的表达有上调趋势,但无显著差异（P>0.05）;添加Trolox后,细胞内活性氧水平被极显著降低（P<0.001）;在分化进程中添加Trolox后,预分化阶段的MYOG和CAV-3及终末分化阶段的MyHC均显著上调（P<0.05）,而Western blotting结果显示MyHC蛋白的表达无显著变化（P>0.05）;免疫荧光结果显示MyHC阳性细胞比例有增多的趋势,但无显著差异（P>0.05）。【结论】Trolox通过降低细胞内的活性氧,促进猪肌肉干细胞的增殖以及分化进程。 相似文献
2.
【目的】探讨白羽王鸽Columba livia骨骼肌卫星细胞的分离、培养和鉴定的方法,建立完整的家鸽骨骼肌卫星细胞的培养体系。【方法】选择孵化16 d的鸽胚作为试验材料,采用组织块贴壁法和胶原酶消化法分离胸肌的骨骼肌卫星细胞并绘制其生长曲线。待卫星细胞分化出肌管后,采用免疫荧光法检测肌球蛋白重链(MyHC)的表达;在细胞分化出肌管前、后分别提取总RNA,采用RT-qPCR方法检测Desmin、Pax7、MyoG和MyoD1基因在细胞分化出肌管前、后的相对表达量。【结果】组织块贴壁法和胶原酶法均能成功地分离出骨骼肌卫星细胞,其生长曲线呈"S"型;该细胞经含体积分数为20%FBS的DMEM高糖培养液培养7 d后视野中出现大量明显可见的肌管,成肌特异性标志MyHC表达呈阳性。RT-qPCR结果表明,Desmin和MyoG基因分化后的相对表达量分别是分化前的5.68和10.38倍,而Pax7和MyoD1基因分化前的相对表达量分别是分化后的7.01和5.51倍。【结论】建立了鸽骨骼肌卫星细胞的培养体系,为今后进行家鸽肌肉发育的研究提供细胞模型。 相似文献
3.
山羊胎儿肌肉干细胞的分离培养与成肌诱导分化 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】通过体外建立安淮山羊胎儿肌肉干细胞分离培养及成肌诱导分化的方法,为进一步研究调控山羊肌肉干细胞增殖与分化的分子机制提供实验材料。【方法】本试验选取山羊胎儿背最长肌肌肉组织,用眼科剪剪成肉糜后,用0.1%的Ⅰ型胶原酶消化40 min,然后利用0.25%的胰酶消化15 min。分离得到的细胞用生长培养基（20%FBS+80%DMEM/F12+青链霉素）培养于37℃、5% CO2培养箱内。培养2h后采用差速贴壁技术对细胞进行纯化,又2h后,重复纯化一次。待细胞生长至70%左右密度时可进行传代培养。每次传代培养均采用差速贴壁30min的方法进一步纯化肌肉干细胞,共纯化至第6代。利用免疫荧光技术检测第6代细胞中肌肉干细胞标记基因Pax7、MyoD1的蛋白表达情况,从而对分离得到的细胞进行鉴定。当肌肉干细胞生长至70%左右密度时,将生长培养基更换为分化培养基（2%FBS+98%DMEM/F12+青链霉素）,诱导细胞向成肌方向分化并观察细胞的形态学变化。细胞诱导分化1d后,采用免疫荧光技术检测肌肉干细胞的分化标记基因Myog的蛋白表达情况。另外,分别提取诱导0、1、3、5、7d后的细胞的总RNA,通过反转录试剂盒反转成cDNA后,利用qPCR测定MyoD1和Myog的相对表达量。【结果】 分离得到的细胞呈贴壁生长,其形态趋于稳定后主要呈长梭形或纺锤形。免疫荧光技术检测的第6代细胞中Pax7和MyoD1蛋白均为阳性表达。采用分化培养基诱导细胞分化后,在显微镜下可观察到随着诱导天数的增加,细胞开始分化、相互融合成肌管且具有一定的方向性。免疫荧光检测结果表明Myog蛋白呈明显的阳性表达。另外,qPCR结果显示,标志基因MyoD1和Myog均有表达,且MyoD1的相对表达量在分化的第1天相比于0天显著升高并维持到第3天,第5、7天开始显著下降但仍显著高于增殖期。Myog在分化不同天数的细胞中的相对表达量具有类似的趋向。【结论】分离得到了纯度较高的安淮山羊胎儿肌肉干细胞,且诱导后展现出较好的成肌潜力。研究结果可为进一步开展肌肉干细胞成肌分化的分子机制研究提供材料来源。 相似文献
4.
【目的】在前期从花椰菜中筛选、鉴定出多个逆境胁迫应答相关ERF（Ethylene-responsive factors）转录因子的基础上,对其中一个未知功能的转录因子BraERF023a进行克隆,并阐释其在盐及干旱胁迫条件下的表达特征及功能。【方法】对花椰菜中的BraERF023a进行克隆,采用MEGA 6等生物学软件对其序列特征进行分析,采用qRT-PCR方法分析BraERF023a在盐及干旱胁迫条件下的表达特征,进而构建过表达载体并转化拟南芥,对BraERF023a过表达转基因拟南芥株系在盐及干旱胁迫下的表型、生存率进行观察、分析。【结果】序列分析证实,花椰菜BraERF023a编码区长度为597 bp,编码含198个氨基酸的蛋白质,其内含有一个AP2保守结构域。BraERF023a在十字花科芸薹属植物中具有很高保守性。转录表达模式分析显示,盐及干旱胁迫条件均可显著诱导花椰菜BraERF023a的表达。进一步的功能分析显示,在盐及干旱胁迫处理条件下,过表达BraERF023a的转基因拟南芥株系比野生型对照生长势更好,植株生存率更高,盐及干旱耐受能力明显增强。【结论】BraERF023a在花椰菜响应盐及干旱胁迫中发挥重要的正向调控作用,过表达BraERF023a可显著提高转化株对盐及干旱的胁迫耐受。 相似文献
5.
【目的】探究蛋白酶体β5亚基（proteasome subunit beta type-5, PSMB5）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,为进一步研究蛋白酶体亚基PSMB5在细胞分化和肌肉发育过程中的调控作用提供依据。【方法】利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,模拟牛骨骼肌生长发育过程,首先检测牛骨骼肌卫星细胞分化前后PSMB5的表达变化,采用qRT-PCR法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后基因表达水平的差异,采用Western blotting 法检测PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后蛋白表达水平的差异。然后设计合成PSMB5的小干扰RNA si-RNA-PSMB5（si-PSMB5）,构建PSMB5过表达质粒载体pcDNA3.1-PSMB5（pcDNA-PSMB5）,采用（Lipofectamine）3000转染试剂将si-PSMB5和pcDNA-PSMB5转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法及Western blotting法检测转染效果。最后采用EdU染色的方法检测干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星增殖的影响;进一步对牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,光学显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞肌管形成状态,Western blotting检测分化标志因子肌球蛋白重链（MyHC）蛋白水平的表达变化,分析干扰和过表达PSMB5对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响,综合分析PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响。【结果】PSMB5在牛骨骼肌卫星细胞分化前后表达水平存在显著差异,牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后PSMB5的mRNA和蛋白表达量均显著高于增殖期（P<0.05）。干扰或过表达PSMB5后,牛骨骼肌卫星细胞EdU阳性细胞率与对照组相比,差异均不显著（P>0.05）。干扰PSMB5的表达后,细胞分化形成的肌管数量明显少于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著低于对照组（P<0.05）;而过表达PSMB5后,细胞分化形成的肌管数量明显多于对照组,分化标志因子MyHC的蛋白表达水平显著高于对照组（P<0.05）。【结论】PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞的增殖没有明显影响,但对牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程具有显著的调控作用。干扰PSMB5表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化进程,而过表达PSMB5可以促进牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化进程。探明PSMB5蛋白对牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的具体调控作用,为进一步开展PSMB5在牛成肌分化中的调控机制研究奠定了基础。 相似文献
6.
【目的】 研究绵羊Myostatin前肽对C2C12细胞分化的影响。【方法】 构建并包装Myostatin前肽基因过表达慢病毒质粒,包装慢病毒,分别用LV-CMV-MSTN-flag-GFP和LV-CMV -GFP慢病毒感染C2C12细胞,检测重组慢病毒对C2C12细胞的感染能力。【结果】 LV-CMV -GFP感染组可见明显的长条状肌管,LV-CMV-MSTN-flag-GFP组只见少量肌管的形成,肌管融合率的测定。未处理组,对照组,试验组肌管融合率分别为5.53%、6.62%、9.38%,试验组即转染Myostatin前肽的肌管融合率显著高于对照组和未处理组(P＜0.05)。【结论】 Myostatin前肽基因的过表达抑制了Myostatin基因的表达,影响肌管的形成,抑制了分化的进程。 相似文献
7.
【目的】肌细胞生成素(myogenin,MyoG) 是生肌调节因子(MRFs)基因家族中唯一能在骨骼肌细胞发育与生长过程中均可表达的调控因子, 在肌肉细胞分化过程中起着中心调控的作用,它正调控着骨骼肌卫星细胞向成熟肌细胞分化的过程,是唯一不可代替的生肌调节因子。MyoG基因在复制、扩增、基因激活、转录、翻译等多级水平上对肌肉发育进行调控。基因转录的起始阶段是机体生长发育因子进行调控的开端,而此阶段调控的实质是通过启动子和上游调控序列的相互作用,调控目的基因的表达。因此克隆MyoG基因的启动子,探讨启动子区域的启动活性,有助于从理论上揭示MyoG基因表达的关键调控位点,同时也有利于揭示肌肉发育调控的相关机理,为治疗人类相关疾病以及改良家畜肉质研究提供实验依据。本研究克隆山羊Myogenin（MyoG）基因的启动子区域,检测其在哺乳动物骨骼肌细胞内的启动活性。【方法】克隆山羊MyoG基因的启动子序列,连入pDsRed2基本骨架构建了以红荧光蛋白基因为标记基因的真核表达载体pDsRed-GoatMyoG(5.3 kb)。表达载体pDsRed-GoatMyoG经酶切和测序鉴定后,分别转染体外培养的绵羊肌卫星细胞、肌管细胞和成纤维细胞,观察红色荧光蛋白表达情况,然后利用实时荧光定量PCR、Western blot和冰冻切片、免疫组化等技术检测细胞转染后标记基因mRNA 和蛋白在体外培养细胞中的的表达活性。pDsRed-GoatMyoG表达载体对小鼠进行肌肉注射,检测GoatMyoG启动子在体内组织中的启动特异性和效率。肌肉注射5 d后,分别取小鼠的注射腿肌肉组织、非注射腿肌肉组织、睾丸组织、肠组织和肝脏组织,通过实时荧光定量 PCR 检测标记基因DsRed在不同组织中的表达情况。【结果】克隆得到的MyoG启动子序列测序正确,载体pDsRed-GoatMyoG经酶切和测序鉴定,证实载体构建成功;转染质粒 pDsRed-GoatMyoG后,肌卫星细胞和肌管细胞在显微镜下均可观察到细胞发红色荧光,成纤维细胞没有红色荧光。通过实时荧光定量PCR检测得出,转基因肌管细胞内GoatMyoG 启动DsRed 基因表达mRNA 的相对量为14.07;通过Western blot技术检测出转基因肌管细胞含有GoatMyoG启动的DsRed蛋白质,在转基因成纤维细胞内没有检测到 DsRed 蛋白质,说明GoatMyoG启动子可在肌肉组织特异性启动外源基因表达。小鼠肌肉注射pDsRed-GoatMyoG质粒后,注射腿肌肉组织内GoatMyoG 启动DsRed 基因转录mRNA 的相对量为212.32,非注射腿肌肉组织内mRNA的相对量为39.76,注射腿肌肉组织和非注射腿肌肉组织内mRNA 的量均是其它组织的1.99倍以上。通过免疫组化技术在注射腿肌肉组织和非注射腿肌肉组织内均可检测到红色荧光蛋白,在睾丸、肠和肝脏内均未检测到DsRed 蛋白。【结论】山羊MyoG启动子可以特异性的在骨骼肌组织驱动外源基因的表达,是一种有效的肌肉特异性启动子。 相似文献
8.
牛LncRNA-133a对骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】 探讨长链非编码RNA LncRNA-133a对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化过程的影响。【方法】 利用测序样品3、6、9月龄胎牛及24月龄成年和牛骨骼肌肌肉组织,qRT-PCR法检测LncRNA-133a的组织时序表达谱。构建牛骨骼肌卫星细胞的体外成肌诱导分化模型,模拟牛骨骼肌的生长发育过程,qRT-PCR法检测LncRNA-133a和肌细胞分化标记因子MyoG、MHC的细胞时序表达谱。利用过表达LncRNA-133载体（pCDNA3.1-EGFP-LncRNA-133a） 或LncRNA-133a抑制物（si-LncRNA 133a） 转染牛骨骼肌卫星细胞,qRT-PCR法检测转染效率以及各转染处理组LncRNA-133a、MyoD、MyoG及MHC基因mRNA的表达水平,Western blotting检测MHC 基因的蛋白表达水平;同时,通过EdU细胞增殖检测、免疫荧光蛋白染色技术检测牛骨骼肌卫星细胞增殖阶段的细胞增殖量和分化阶段的肌管融合程度。【结果】 组织表达谱分析发现LncRNA-133a在3月龄胎牛肌肉组织中表达量最高,6月龄胎牛肌肉组织中次之,9月龄胎牛及成年牛肌肉组织中表达量最低,时序表达呈下降趋势;利用成功构建的牛骨骼肌卫星细胞体外诱导分化模型,进行LncRNA-133a、MyoG、MHC的细胞时序表达谱分析,结果发现在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中（D0-D3）,肌分化标记因子MyoG、MHC的表达水平逐渐升高,LncRNA-133a的表达在分化阶段呈上升趋势,且分化48 h时（D2）表达量最高;成功构建的过表达LncRNA-133a或抑制LncRNA-133a的牛骨骼肌卫星细胞模型,在增殖期（D0）：与对照组相比,过表达LncRNA-133a处理组EdU增殖染色检测得到EdU阳性细胞数显著增加（P<0.01）,而LncRNA-133a抑制处理组EdU阳性细胞数显著减少（P<0.01）;在分化48 h时（D2）：与对照组相比,LncRNA-133a过表达处理组肌细胞分化标记因子MyoD、MyoG及MHC的mRNA表达水平显著升高（P<0.05）,Western blotting检测MHC蛋白表达量显著增加（P<0.01）,且MHC蛋白的免疫荧光蛋白染色检测观察到融合肌管的体积占比更大;而LncRNA-133a抑制处理组MyoD、MyoG及MHC的mRNA表达水平均降低,其中MyoG显著降低（P<0.05）, MHC蛋白表达量显著减少（P<0.01）,同时MHC蛋白融合肌管的体积占比也降低。【结论】 研究证实LncRNA-133a具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖及分化的作用,为进一步挖掘LncRNA-133a调节牛骨骼肌卫星细胞增殖分化调控网络机制奠定了基础。 相似文献
9.
【背景】肌肉可以维持哺乳动物运动功能并调节机体代谢,它的数量和分布对肉质有重要影响,骨骼肌的生长发育及其遗传特性在很大程度上影响甚至决定家畜的产肉量和肉品质,研究骨骼肌的生长发育具有重要意义。TP53INP2对自噬的调控作用以及对前体脂肪细胞分化的调控机制已有研究,而对于牛成肌细胞分化的影响尚未报道。【目的】探究TP53INP2对秦川牛成肌细胞分化的影响,为肉牛肉用性状分子育种工作提供理论依据。【方法】利用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR）技术检测了TP53INP2在24月龄秦川牛不同组织中的表达特性,同时分析了其在体外培养的牛骨骼肌成肌细胞不同分化时期的表达规律;合成TP53INP2基因siRNA并转染秦川牛成肌细胞,转染后12h进行诱导分化,观察成肌细胞表型变化,并利用RT-qPCR技术和Western Blot技术分别检测其在诱导分化第四天时分化标志基因和蛋白的表达情况。【结果】1.RT-qPCR结果显示,TP53INP2在成年秦川牛背最长肌组织中表达量最高,在小肠组织中表达量最低。TP53INP2在成年牛心脏、肝脏、肾脏、网胃、瘤胃中表达量较高,在其余组织中表达量较低（与背最长肌相比）。2.随着成肌细胞的分化,该基因在第0—4天表达量呈上升趋势且在第4天达到峰值,随后表达量呈下降趋势。3.在成肌细胞中干扰TP53INP2后,试验组肌管的数量和长度均显著低于对照组。4.干扰TP53INP2并提取细胞总RNA,RT-qPCR结果显示,成肌细胞分化标志基因肌细胞生成素（MYOG）和肌球重链蛋白3（MYH3）相对于对照组表达量显著降低。5.干扰TP53INP2并提取细胞总蛋白,Western Blot结果显示,试验组MYOG、MYH3、MYOD的蛋白表达量均降低且与对照组相比差异极显著。【结论】干扰TP53INP2对牛成肌细胞的分化具有抑制作用,提示该基因可能对秦川牛肌肉组织的生长发育具有重要的调控作用,可对其进行深入的功能研究以期用于肉牛的分子育种实践中。 相似文献
10.
【目的】独行菜在种子萌发和幼苗生长阶段可耐受一定程度的低温胁迫,研究独行菜的低温耐受机制。【方法】设计兼并引物,从独行菜冷诱导叶片的cDNA中克隆获得LaCBF3和LaCOR15a基因核心片段。利用半定量RT-PCR法分析两个基因在不同胁迫处理下的表达情况。【结果】获得442 bp LaCBF3及405 bp LaCOR15a核心片段,经比对与拟南芥CBF3、COR15a基因核心片段相似性分别为84.38%、81.8%。半定量RT-PCR结果显示在独行菜幼苗中,LaCOR15a基因不仅响应低温胁迫,还能迅速响应高盐、干旱及ABA处理,不同条件下表达各有差异。LaCBF3仅对低温胁迫响应迅速。【结论】LaCBF3、LaCOR15a在独行菜幼苗响应低温胁迫的分子机制中具有重要的调控作用,且LaCOR15a基因也应答干旱、高盐等非生物胁迫。 相似文献
11.
阻断PI3K/AKT通路通过激活FoxO1抑制 猪骨骼肌卫星细胞分化 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】在骨骼肌生长或损伤刺激下,骨骼肌卫星细胞被激活、增殖分化形成肌管,促进骨骼肌的生长发育或修复组织创伤。FoxO1负调控骨骼肌的生成,但在骨骼肌卫星细胞分化过程中的作用未见报道。因此,笔者探索FoxO1对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响,希望为深入研究FoxO1调控骨骼肌生长发育的作用机理奠定基础。【方法】以1-3日龄健康大白猪为材料,采用单根肌纤维法分离培养猪骨骼肌卫星细胞,接种第2天、第4天和第6天在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。在细胞分化第8天,用免疫荧光染色方法染肌管,DAPI染核,并在荧光倒置显微镜下观察拍照。 待细胞汇合至70%-80%时,将培养基换成含50 nmol•L-1 渥曼青霉素（wortmannin,WM）的分化培养基,分别于细胞分化第0天、第4天和第8 天收集细胞,提取总RNA和总蛋白,采用real-time qPCR和Western blotting方法检测WM对FoxO1以及骨骼肌卫星细胞分化标志基因表达的影响。【结果】猪骨骼肌卫星细胞在接种第2天开始贴壁,呈梭形。第4天细胞数量增加,部分发生融合。第6天时细胞呈方向性生长。第8天细胞进一步融合形成肌管。WM处理组的FoxO1 mRNA表达水平未发生显著变化（P＞0.05）,非磷酸化的FoxO1蛋白表达显著高于对照组（P＜0.05）,而p-FoxO1蛋白表达较对照组显著下降（P＜0.05）。WM处理组的细胞在分化第8天,虽然也出现了蜂窝状生长,但是与对照组相比细胞未呈方向性生长并形成肌管。Western blotting结果显示,WM明显抑制猪骨骼肌卫星细胞分化早期标志基因MyoD、中后期标志基因MyoG和末期标志基因MyHC蛋白的表达。【结论】以WM阻断PI3K信号通路能使FoxO1去磷酸化,抑制猪骨骼肌卫星细胞的分化,延迟肌管的形成,并降低成肌分化标志基因MyoD、MyoG和MyHC的表达。总之,阻断PI3K信号通路通过激活FoxO1抑制猪骨骼肌卫星细胞分化。 相似文献
12.
猪骨骼肌卫星细胞分离培养、鉴定及其生物学特性 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37 ℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程中关键基因的表达。【结果】通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,刚分离的细胞折光性强,贴壁后呈梭形或纺锤形,此后细胞延展并开始快速增殖。卫星细胞特异标志蛋白Pax7、MyoD细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,表明分离细胞为骨骼肌卫星细胞。骨骼肌卫星细胞增殖过程经潜伏期、生长期最终达到平台期,细胞生长曲线呈“S”型。当细胞生长至90%密度时,卫星细胞会出现自融合现象。对分离的骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化后,可见邻近卫星细胞融合形成大量粗长肌管,多核肌管呈方向性排列,成肌标志蛋白MHC染色呈阳性。qRT-PCR结果显示标志基因MyoD、MyoG在成肌诱导分化过程中二者均呈先上升后下降趋势。经成脂诱导后细胞形态变为三角形,连续诱导发现脂滴出现并聚集成大脂滴,油红O染色可见大量红色葡萄样脂滴。油红O定量检测结果表明,成脂诱导过程中甘油三酯含量呈稳步上升趋势,各时间点均存在极显著差异（P<0.01）。qRT-PCR结果显示,PPARγ基因表达量在诱导中后期高表达;FABP4在诱导分化第6天达到最高,极显著高于其余时间点（P<0.01）;CEBP/β和HSL表达趋势一致,均呈先升高后降低趋势。诱导成骨分化后,发现细胞形态变为不规则状,诱导后期细胞复层生长形成骨钙结节,茜素红染色可见圆形不透明钙化结节,数量和密度较未诱导时期都明显增加,结果表明细胞出现成骨向分化。成骨标志基因BGLAP、RUNX2的表达量也随诱导进程呈稳步上升趋势,相比未诱导细胞差异极显著（P<0.01）。【结论】建立了基于联合酶消化和反复差速贴壁实现猪骨骼肌卫星细胞分离和纯化的方法,所得细胞增殖能力强且具有多向分化潜能,为猪骨骼肌卫星细胞作为种子细胞用于未来组织工程研究提供了技术平台。 相似文献
13.
【目的】研究苹果蠹蛾（Cydia pomonella）几丁质脱乙酰基酶2（chitin deacetylase 2,CDA2）的分子特性和表达模式,为新型杀虫剂靶标筛选提供理论依据。【方法】基于苹果蠹蛾转录组和基因组数据,通过同源比对获得苹果蠹蛾CDA2的相关信息;新鉴定的CpCDA2a和CpCDA2b与其他昆虫中已鉴定的CDA2氨基酸序列进行多序列比对,并采用MEGA7软件邻接法（neighbor-joining,NJ）构建系统发育树;通过生物信息软件预测CpCDA2a和CpCDA2b两个剪切体的蛋白功能域和三维结构并分析其差异,并通过在线软件对其分子量、等电点和亲/疏水性等蛋白理化性质及糖基化修饰位点等方面进行分析比较;采用荧光定量PCR检测CpCDA2a和CpCDA2b两个剪切体在苹果蠹蛾不同发育时期及其幼虫不同组织的表达情况,以及注射蜕皮激素后其表达量的变化趋势。【结果】获得了苹果蠹蛾CDA2的两个可变剪切体CpCDA2a和CpCDA2b的全长CDS序列及其内含子和外显子位置信息;分析发现两个剪切体的蛋白序列均具有信号肽、几丁质结合域（ChBD）、低密度脂蛋白受体域（LDLa）和几丁质脱乙酰基催化域（CDA）等功能域。多序列比对和聚类分析结果表明,不同昆虫间CDA2差异剪切类型非常类似,相同目昆虫的序列以较高的置信度聚为一支。三维结构模拟与比较发现两个剪切体的ChBD功能域在结构上存在较大差异;理化性质分析显示两个剪切体的亲/疏水性和糖基化位点也存在差异。不同发育时期表达量分析表明,CpCDA2a主要在幼虫期高表达,CpCDA2b主要在蛹的前期和中期高表达,而且在幼虫蜕皮前和蜕皮后CpCDA2a和CpCDA2b表达量均会显著上调;不同组织的表达量分析表明,CpCDA2a和CpCDA2b均在表皮中表达量最高,而CpCDA2b在头部的表达量也较高。对注射蜕皮激素后幼虫中CpCDA2a和CpCDA2b表达量分析显示,与对照相比在注射蜕皮激素后CpCDA2a的表达量在24 h和48 h均有所上调,但差异不显著,而CpCDA2b在24 h和48 h均显著上调。【结论】苹果蠹蛾CDA2的转录本存在两个可变剪切体CpCDA2a和CpCDA2b,根据对其分子特性、发育阶段和组织表达谱、以及注射蜕皮激素后表达动态等方面的综合分析,推测两者均参与苹果蠹蛾蜕皮和新表皮形成过程,但由于可变剪切的序列差异导致的蛋白结构和理化性质上的差异造成了两者在功能上的分化。 相似文献