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《分子植物育种》2016,(1)
在转基因植物及其产品的成分检测中,内参照基因(endogenous reference gene)起着重要的作用,木薯内参照基因的研究是转基因木薯成分定性PCR和定量PCR检测的基础。本研究选择木薯的亚麻苦苷酶(linamarase,LAM)和Polyubiquitin(PUBQ)基因为研究对象,运用定性PCR的方法在22种木薯的不同品种中进行稳定性分析,在12种大戟科其它植物、20种非大戟科植物及五类主要转基因作物的混合样品(玉米,大豆,水稻,棉花和油菜)中对LAM2和PUBQ1定性PCR引物进行特异性检测分析及灵敏度检测分析。结果显示:LAM2和PUBQ1引物在木薯的不同品种中均能得到稳定性扩增;在12种大戟科其它植物、20种非大戟科植物能够进行特异性扩增,没有发现非特异性扩增产物出现;LAM2在五类主要转基因作物的混合样品(玉米,大豆,水稻,棉花和油菜)中也没有非特异性扩增产物出现,而PUBQ1在五类主要转基因作物的混合样品(玉米,大豆,水稻,棉花和油菜)中却有很多的非特异性扩增产物出现。灵敏度检测发现定性PCR LAM2检测方法的灵敏度达到质量百分含量0.01%,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测结果表明LAM2的灵敏度可达到0.001~0.000 1 ng/μL。选择部分品种的PCR扩增产物进行测序,序列分析表明LAM2在不同品种的木薯的基因组DNA均可以扩增到293 bp的核苷酸片段,比对分析表明所获得的木薯不同品种中LAM2 PCR扩增片段的核苷酸序列一致没有发现变异位点。研究结果表明LAM2引物扩增系统初步符合内参照基因的种内一致性,稳定性,种间特异性的特点,灵敏度检测的要求可应用于转基因木薯成分定性和定量PCR检测。 相似文献
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重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)是以T4噬菌体的核酸复制机制为基本原理,模仿细胞内的核酸复制机制的一种新兴恒温核酸扩增技术。在多种酶的辅助下,31℃~37℃下恒温20 min即可完成核酸的体外扩增。它具有反应快速、高敏感性、高特异性、低设备依赖性等传统体外核酸扩增技术所不具备的优点。利用RPA技术可以在简易实验设备甚至野外条件下实现对核酸的快速扩增,结合侧流层析试纸技术或荧光检测装置即可对扩增结果进行快速定性或定量检测。但是,RPA技术作为一门新兴技术,在研究方面的应用鲜有提及,尤其在国内。本综述了RPA技术的原理、使用条件、优缺点及其在食品安全检测方面的应用,旨在为该技术今后的深入研究和应用提供一定的参考。 相似文献
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转基因水稻PA110-15基于RPA等温扩增及DNA试纸条联检的品系特异性检测方法 总被引：1，自引：0，他引：1
《分子植物育种》2017,(12)
水稻作为最重要的粮食作物之一,其转基因安全性一直受到各国政府和人民的广泛关注。为了保障和引导公众对转基因水稻的正确而全面的认识,转基因生物安全检测工作必不可少。在目前的转基因检测工作中,核酸扩增技术是最为常用的检测方法。PCR技术是最成熟、应用最广泛的一种核酸扩增技术。然而,PCR技术对温控条件的极度依赖性制约它在田间的现场快速检测。本研究以转基因水稻PA110-15为对象,建立了重组酶聚合酶等温扩增及DNA试纸条联检的品系特异性检测方法,减少了对专用仪器的依赖,为快速现场转基因检测提供了新的解决方案。 相似文献
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转基因玉米CM8101特异性定性PCR检测方法 总被引：1，自引：0，他引：1
旨在为转基因安全监管提供技术支撑,本研究建立了转基因玉米CM8101定性检测方法。根据CM8101转基因玉米插入序列信息,于3′端侧翼序列处设计PCR引物。通过扩增体系优化、特异性测试、灵敏度测试、稳定性测试等技术参数的测试建立了转基因玉米CM8101定性检测方法。结果表明:本特异性检测方法各项参数符合相关转基因分子检测标准的要求,具有良好的品系特异性,方法检测灵敏度可达0.1%。CM8101是中国自主研发的具有产业化应用前景的转基因玉米新品系,本方法为品系和其衍生产品的鉴定提供技术手段。 相似文献
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植酸酶基因在农业生产中具有很高的应用价值,正被广泛用于农作物的基因工程研究。为了满足转植酸酶基因作物安全监管的需要,通过优化PCR检测条件,建立了植酸酶基因特异性定性PCR检测方法。该方法具有良好的扩增特异性和检测灵敏度,可以满足我国植酸酶转基因作物监管需要。此外,我们将6大作物(小麦、水稻、棉花、大豆、玉米和油菜)的内标准基因和植酸酶基因克隆到同一载体上,构建成了阳性质粒分子pBS Endogenous-phytase。该质粒分子适用于这6大作物中植酸酶基因的筛查检测。本研究为转植酸酶基因作物的安全监管提供了阳性材料和检测方法。 相似文献
6.
通过定性PCR扩增了转基因水稻M12转化体特异性片段和水稻内标基因(sps)片段, 将PCR产物酶切连接后构建到T载体, 得到适于转基因水稻M12品系特异性PCR检测的质粒分子pM12, 建立了事件特异性定性、定量PCR检测方法。定性PCR结果表明, 本方法可特异性检测出M12, 检测限可达100拷贝单倍体水稻基因组; 定量PCR结果表明, M12和sps定量PCR标准曲线R 2为0.998和0.997, 扩增效率为95.3%和108.4%, 重复性分析标准偏差范围为0.043~0.276, 定量极限和检测极限可达100和10拷贝。对转基因含量为1.0%的混合样品定量结果的相对偏差在8.0%以内。本研究建立的方法可用于转基因水稻M12及其加工产品成分的检测。 相似文献
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大连齿兰环斑病毒RT-PCR检测体系的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
《分子植物育种》2017,(2)
齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus,ORSV)是严重危害兰科植物的主要病毒之一。本研究根据NCBI基因库中ORSV外壳蛋白基因设计特异性引物,应用RT-PCR方法对ORSV进行检测研究。本试验所使用的植物总RNA提取方法,可以提取出完整且纯度高的总RNA,能够满足RT-PCR的要求;本研究所建立起的ORSV RT-PCR检测体系,可以从感病的指示植物及染病蝴蝶兰中扩增出与预期的332 bp大小完全一致的扩增产物,而健康的指示植物无此扩增产物。对此片段的测序研究也证明了RT-PCR的检测。利用BLAST及DNAMAN 6.0.3.99软件将我们检测的蝴蝶兰齿兰环斑病毒与来自中国海南、台湾以及新加坡的病毒分离物进行同源性分析,其同源性均达98%以上。 相似文献
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转基因玉米MIR162是美国先正达公司开发出来的新型抗鳞翅目昆虫的转基因玉米品种。本研究目的在于建立该品系转化事件特异性定性、定量检测方法并形成定性检测国家标准。定性PCR体系经实验室内部比对及实验室间循环验证结果表明,该体系特异性强,灵敏度较高(0.1%),具有良好的重复性、再现性。Taqman探针实时荧光PCR检测结果表明,所设计的探针特异性强,检测低限(LOD)在0.01%以下;定量标准曲线R2均为0.999,扩增效率为98.622%和99.602%,SD范围为0.014~0.209,RSD的范围为0.049%~0.879%,稳定性好;对转基因含量为1.0%、0.5%、0.1%的样品定量结果相对偏差在8%以内,结果较为准确。本研究建立的方法完全可用于含转基因玉米MIR162成分样品的检测。 相似文献
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本研究创建一种简单快捷、成本低廉、灵敏准确及可靠性强的高通量鉴定转基因玉米MON89034转化体的快速检测方法。采用多重实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)对转基因玉米MON89034品系进行检测,并针对转基因玉米MON89034靶标基因设计高效稳定的引物和探针,使用zSSIIb基因作为内源基因,避免检测出现假阴性,将反应体系及条件优化后,用实时荧光定量PCR仪进行扩增,初步建立转基因玉米MON89034双重实时荧光PCR检测方法,通过对该方法进行特异性和大样本可靠性测试验证,继而创建出一种高通量鉴定转基因玉米MON89034转化体的检测方法。通过建立的双重荧光定量PCR方法对转基因玉米、非转基因玉米和转基因大豆的DNA混合模板检测得出的结果表明,多种作物DNA混合模板可在单根PCR反应管内实现对zSSIIb基因和MON89034的同时检测,并在2 h内完成检测得到准确结果。目前,建立的该双重实时荧光PCR方法可用于多个转基因作物样品间快速筛查,检测快速,结果准确,可满足大多数检测机构日常检测的需求。 相似文献
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内标准基因对于转基因植物及其产品的定性定量PCR检测起着决定性的作用,木薯内标准基因的系统研究是木薯转基因成分检测的基础。在木薯的DFCI（http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/plant.html）数据库中,选择了有可能作为木薯内标基因的一些EST序列,包括亲环蛋白2（cyclophilin type 2,DB934316）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因B亚单位（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase B subunit,TC445）GAPDH、Actin 基因（TC2158与 TC3381的拼接序列）、Alpha-tubulin （TC8072）基因,Polyubiquitin（TC9946）,亚麻苦苷酶 （linamarase,TC1540）六个基因序列,设计了7对定性PCR的引物（CP2、Actin、GAPDH、PUBQ2、Tublinα1、Tublinα2和 LAM1）,并进行了种内一致性、稳定性和种间特异性测试分析。结果表明只有木薯的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因B亚单位的GAPDH定性PCR引物扩增系统在木薯的22个不同品种中都能够得到一致性稳定性的扩增结果,在大戟科其它植物及其它非大戟科植物没有发现非特异性扩增产物。另外六个基因（CP2、Actin、PUBQ2、Tublinα1、Tublinα2和 LAM1）的定性PCR引物扩增系统在大戟科其它植物及非大戟科植物中都有非特异性的扩增产物。因此GAPDH定性PCR引物扩增系统初步符合内标准基因的种内一致性,稳定性,种间特异性的特点,可应用于转基因木薯成分定性PCR检测。 相似文献
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《分子植物育种》2017,(11)
利用hi TAIL-PCR方法研究了转基因水稻Bar Kasalath-01中外源基因在基因组上插入位点的序列特征,获得了外源基因T-DNA右边界旁侧序列511 bp,与水稻基因组数据库比对发现,外源基因插入位点位于水稻基因组第8号染色体的第3 326 720处。根据整合位点水稻基因组序列和外源基因T-DNA左边界序列设计引物,扩增得到了左旁侧序列783 bp。基于左右旁侧序列,建立了转基因水稻Bar Kasalath-01的事件特异性定性PCR检测方法,扩增片段分别为783 bp和411 bp。该方法特异性强、灵敏度高,能够在Bar Kasalath-01基因组DNA含量为0.1%的模板中检测出转基因成份。依据旁侧序列,还建立了快速鉴定转基因后代植株基因型的3引物PCR检测方法。这些方法的建立,实现了对转基因水稻Bar Kasalath-01转化事件的特异性检测。 相似文献
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转基因玉米MIR162转化事件特异性检测方法及其标准化 总被引：1，自引：0，他引：1
转基因玉米MIR162是美国先正达公司开发出来的新型抗鳞翅目昆虫的转基因玉米品种。本研究目的在于建立该品系转化事件特异性定性、定量检测方法并形成定性检测国家标准。定性PCR体系经实验室内部比对及实验室间循环验证结果表明,该体系特异性强,灵敏度较高(0.1%),具有良好的重复性、再现性。Taqman探针实时荧光PCR检测结果表明,所设计的探针特异性强,检测低限(LOD)在0.01%以下;定量标准曲线R2均为0.999,扩增效率为98.622%和99.602%,SD范围为0.014~0.209,RSD的范围为0.049%~0.879%,稳定性好;对转基因含量为1.0%、0.5%、0.1%的样品定量结果相对偏差在8%以内,结果较为准确。本研究建立的方法完全可用于含转基因玉米MIR162成分样品的检测。 相似文献
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为对转基因玉米MIR162的进口实行监测、规范转基因玉米在国内市场中的流通,建立一种转基因玉米MIR162准确快速的检测方法,通过设计转基因玉米MIR162品系特异性序列的引物和探针,摸索和优化多重荧光PCR体系和参数,开发建立多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162。结果表明,转基因玉米MIR162品系标准品和平行样品中内标基因和品系特异性基因均出现明显扩增曲线,其他转基因玉米品系标准品仅内标基因有扩增曲线,空白对照无扩增曲线,说明该TaqMan-MGB探针对转基因玉米MIR162品系具有扩增特异性。该方法可作为鉴定筛查转基因玉米MIR162品系及其转化体成分的有效方法,用于规范管理转基因产品在市场上的流通。 相似文献
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甜菜碱是在生物界广泛存在的一类细胞相容性物质,它不仅能使细胞在干旱等胁迫条件下与环境保持渗透平衡,而且还具有稳定复杂蛋白质高级结构的能力。胆碱单氧化酶(CMO)在植物体中是催化胆碱转变为甜菜碱的关键酶,单独转化CMO基因的转基因植物可以完成甜菜碱的合成,起到抗盐、耐旱的作用。小叶杨是我国特有乡土树种,具有抗旱、耐瘠薄、适应性广、生长优良、寿命长等特性,在荒沙及黄土高原区均能生长。本研究以小叶杨为材料构建了干旱胁迫和正常生长条件下的cDNA文库,以特异性引物从中扩增出一条1269bp大小的DNA片段,经序列分析证实该片段编码胆碱单氧化物酶(CMO);将该片段构建入植物表达载体pBI121中,在落叶松杂交育种中利用花粉管通道法将带有该CMO基因的植物表达质粒转入杂种落叶松,收获球果取出种子,提取转化种子发芽长出幼芽的DNA,特异性PCR扩增和Southern、WesternBlotting检测证实落叶松中CMO基因的插入。因此,我们不仅克隆得到了小叶杨编码胆碱单氧化物酶(CMO)的基因,还将其导入杂种落叶松,得到CMO超重表达的转基因杂种落叶松。 相似文献
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本研究成功建立了玉米细菌性枯萎病菌的PCR检测方法.该方法根据细菌ITS序列的特异性,设计了对玉米细菌性枯萎病菌具有稳定性点突变的特异性引物及探针,并对5株玉米细菌性枯萎病菌及18种植物原性细菌的DNA进行了PCR、实时荧光PCR及PCR结合变性高效液相色谱技术(PCR-DHPLC)检测.结果表明,几种方法特异性强,检测灵敏度均为菌液浓度102 cfu/mL,PCR-DHPLC技术具有检测成本较低、高通量、自动化程度高、污染风险小及鉴定结果准确等特点,能够满足快速、准确诊断玉米细菌性枯萎病菌的要求. 相似文献
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《分子植物育种》2017,(11)
随着转基因技术的成熟,转基因生物越来越多,关于转基因生物的争议也越来越受到人们的关注。建立一套能够简便、快速、准确的检测转基因林木的外源基因技术,对转基因林木的研究有重要意义。采用灵敏、快速的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,建立一套以Bt Cry1Ac或Npt II基因为靶标的转基因林木的检测方法。针对靶标基因的6个区域设计4种特异引物,优化LAMP-PCR反应体系中的各个成分,根据直接观察产物中焦磷酸镁的沉淀情况、Gold View核酸染色剂对其产物染色情况来判断反应结果并与将产物经过1%琼脂糖电泳的情况进行对比。比较LAMP-PCR和常规PCR两种不同检测方法的灵敏度。对转基因杨树不同无性系中多种外源基因进行检测。筛选出了最佳的引物,确定出了最优的反应体系:3 mmol/L Mg2+、1.4 mmol/L Bst、1.4 mol/L Betaine、7:1的10μmol/L内外引物比、2μL10 mmol/L d NTP、以及2μL浓度为200 ng/μL的DNA模板。在PCR仪65℃等温条件下保温90 min,可直接观察到焦磷酸镁的白色沉淀;经过Gold View核酸染色剂染色,可在紫外灯下观察到荧光绿色;经过1%琼脂糖电泳的检测,可观察到清晰的弥散状条带。通过对比试验得出LAMP-PCR的灵敏度比常规PCR要高。对实验室多个转基因杨树无性系目的基因的检测,证明了LAMP-PCR在转基因林木外源基因检测中的较高可靠性。本研究在国内外首次采用环介导等温扩增技术检测转基因林木,建立了一套更简便、灵敏、快速、可靠的转基因林木的LAMP-PCR检测方法。该技术在恒温65℃的条件下保温90 min即可完成转基因林木的检测,既节省了时间,又降低了成本,为转基因林木的检测研究提供了一种新的技术。 相似文献
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本研究旨在针对甜瓜种子中携带的黄瓜花叶病毒(CMV)和小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV),建立可视化环介导等温扩增检测方法。根据CMV和ZYMV外壳蛋白(CP)基因的保守序列,分别设计并筛选出2套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,通过对反应体系中主要影响因素的优化,建立适用于快速检测CMV和ZYMV的RT-LAMP检测方法。对优化后的2种LAMP检测方法进行特异性和灵敏度验证。结果表明,建立的2种LAMP检测方法分别能够特异性地检测出CMV和ZYMV,检测灵敏度较常规RT-PCR分别高出10倍和100倍,并且可通过肉眼观察直接对反应结果进行判定。该方法的建立为基层及现场快速检测甜瓜种子的带毒情况提供了新方法。 相似文献