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1.
植物次生代谢产物白藜芦醇具有抗肿瘤、保护心血管、抗氧化的药理作用。通过分子生物学技术利用带有13个氨基酸的链接序列(linker)将来自烟草的4-香豆酰辅酶A连接酶(4-Coumarate-CoA ligase,4CL)和虎杖的白藜芦醇合酶(Stilbene synthase,STS)的基因连接,构建成融合基因,并转入原核表达载体。为后续的白藜芦醇的代谢工程奠定了基础。但该研究中所构建的融合基因与原基因相比有7个碱基突变,导致4个氨基酸的改变。这些突变是否会影响到融合酶的活性,试验所引入的13个氨基酸的linker对于融合蛋白活性的影响等都还待后续进一步研究。 相似文献
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白藜芦醇具有抗菌、抗癌、抗肿瘤、保护心血管、抗氧化等众多药理作用。4-香豆酰辅酶A连接酶(4-Coumarate-CoA ligase,4CL)和芪合酶(Stilbene synthase,STS)是其生物合成的关键酶和限速酶。本研究利用悬挂PCR(Overlap PCR)技术将白藜芦醇生物合成的最后两个关键酶4CL和STS的基因融合,构建原核表达pET30a-Nt4CL::PcPKS5重组质粒,原核表达Nt4CL::PcPKS5融合酶蛋白。预测其共编码945个氨基酸,含15个氨基酸的过渡氨基酸链(Linker),编码蛋白质分子量(Mr)为102.8kDa,等电点(pI)为5.69。原核表达筛选结果表明:温度为25℃,IPTG浓度为1.0mmol/L,诱导起始OD600值在0.4~0.6之间,诱导4h时目标蛋白的表达量最高。细胞破碎后,经Ni 2+亲和柱纯化、PD-10柱脱盐后可纯化得到融合蛋白。本研究为通过分子生物学途径合成白藜芦醇奠定基础。 相似文献
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以旋毛虫新生幼虫期(NBL)脱氧核糖核酸酶-Ⅱ(DNaseⅡ)基因家族中全长序列T31D4为研究对象,对其融合蛋白的核酸酶活性进行鉴定并摸索最佳酶切条件;通过序列分析预测其关键活性氨基酸位点,同时利用基因点突变技术对所预测的位点进行验证。结果表明:旋毛虫的DNaseⅡ具有核酸酶酶切活性,最佳酶切pH为5.0,同时发现其在中性(pH 7.0)及偏碱性(pH 8.0)下仍具有活性。利用Maga2软件对包括旋毛虫在内的以及业已发现的来自38个物种的DNaseⅡ的94个氨基酸序列进行比对,发现一个所有物种DNaseⅡ均高度保守的组氨酸位点,该结果与目前国际上所预测的DNaseⅡ关键活性氨基酸位点不同,目前国际上所预测的组氨酸位点在旋毛虫的DNaseⅡ序列中并非组氨酸(H),而是丝氨酸(S)或赖氨酸(K);通过点突变技术进一步验证这个组氨酸位点才是所有物种DNaseⅡ真正的活性氨基酸位点。同时推测旋毛虫的DNaseⅡ可能为一种新类型的DNaseⅡ。 相似文献
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以旋毛虫新生幼虫期(NBL)脱氧核糖核酸酶 Ⅱ(DNaseⅡ)基因家族中全长序列T31D4为研究对象,对其融合蛋白的核酸酶活性进行鉴定并摸索最佳酶切条件;通过序列分析预测其关键活性氨基酸位点,同时利用基因点突变技术对所预测的位点进行验证。结果表明:旋毛虫的DNaseⅡ具有核酸酶酶切活性,最佳酶切pH为5.0,同时发现其在中性(pH 7.0)及偏碱性(pH8.0)下仍具有活性。利用Maga2软件对包括旋毛虫在内的以及业已发现的来自38个物种的DNaseⅡ的94个氨基酸序列进行比对,发现一个所有物种DNaseⅡ均高度保守的组氨酸位点,该结果与目前国际上所预测的DNaseⅡ关键活性氨基酸位点不同,目前国际上所预测的组氨酸位点在旋毛虫的DNaseⅡ序列中并非组氨酸（Ｈ）,而是丝氨酸(S)或赖氨酸(K);通过点突变技术进一步验证这个组氨酸位点才是所有物种DNaseⅡ真正的活性氨基酸位点。同时推测旋毛虫的DNaseⅡ可能为一种新类型的DNaseⅡ。 相似文献
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【目的】明确白藜芦醇对杜长大猪UCP3基因表达及脂肪代谢的影响,为揭示猪优良肉质性状形成机制打下基础。【方法】提取2月龄杜长大猪皮下脂肪组织RNA,采用RT-PCR扩增杜长大猪UCP3基因编码区(CDS)序列,运用在线软件对其进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测白藜芦醇(400 mg/kg,饲喂30 d)对杜长大猪脂肪中UCP3基因表达的影响。【结果】从杜长大猪皮下脂肪组织中成功克隆获得UCP3基因CDS序列,全长927 bp,共编码308个氨基酸,其蛋白分子质量33673.09 Da,理论等电点(pI)9.44;与普通猪的UCP3基因序列相比,杜长大猪UCP3基因编码序列共有9处发生碱基突变,其中4处为错义突变,导致UCP3蛋白有4处氨基酸突变,分别为第74位脯氨酸(Pro)→亮氨酸(Leu)、第150位甘氨酸(Gly)→精氨酸(Arg)、第203位Arg→Gly和第259位缬氨酸(Val)→Leu。杜长大猪UCP3基因CDS序列与普通猪UCP3基因CDS序列的同源性为99.0%,其UCP3蛋白二级结构中以α-螺旋占比最高(46.43%)、β-转角占比最低(7.47%),属于亲水性蛋白。饲喂白藜芦醇(400 mg/kg)能极显著上调杜长大猪皮下脂肪UCP3基因表达(P0.01),其相对表达量是对照组(不饲喂白藜芦醇)的2.06倍。【结论】白藜芦醇是通过上调杜长大猪UCP3基因表达而影响其脂肪代谢。 相似文献
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【目的】3-磷酸甘油酰基转移酶(GPAT)催化三酰甘油(TAG)生物合成途径中的第1步酰化反应,TAG合成能力是油料作物的关键性状,但亦与人类肥胖症密切相关,了解GPAT结构与功能的内在关系对于这一性状的遗传或化学遗传调控至关重要。本研究旨在鉴定调控植物GPAT活性的关键氨基酸位点。【方法】运用定点突变技术构建了58个GPAT9突变基因,结合GPAT特异的酵母遗传互补法,剖析单一和多个氨基酸位点改变对GPAT9酶活性的影响。【结果】通过对拟南芥Arabidopsis thaliana AtGPAT9和油菜Brassica napus BnGPAT9的19个氨基酸残基进行分析发现：AtGPAT9的N端6个磷酸化位点的单独突变(T10A、S11A、S13A、S28A、S30A和S31A)不能增强AtGPAT9在酵母异源表达时的活性。相反,其他6个位于酰基转移酶保守结构域外的氨基酸残基(85、114、119、230、237、322位)的改变能够显著影响GPAT9酶活性。发现这些氨基酸残基之间存在交互作用,例如,3个位点同时突变(Y85W/N119H/S237N)能使AtGPAT9活性大幅上升... 相似文献
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研究克隆、表达了蜡状芽孢杆菌来源的环糊精糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase,EC 2.4.1.19)基因,研究了其酶学性质,并在此基础上构建突变菌株以探究关键氨基酸位点与产物特异性的关系。结果表明,重组CGTase的最大比活力达5 292 U/mL,分子量约为68 kDa,最适温度和pH分别为55℃和8.5;以淀粉为底物催化合成的主要产物是β-环糊精(β-CD);通过序列对比选取了第47位氨基酸(Ala)进行定点突变,构建了A47R、A47M、A47S、A47Y。研究发现活性区域中第47位氨基酸对于产物特异性和产量具有一定的影响,其中亲水性氨基酸更利于CDs(尤其β-CD)的合成,这为酶法合成β-CD的工业应用提供了方法。 相似文献
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《南京农业大学学报》2016,(3)
[目的]通过表达载体p ET-28a(+)在大肠杆菌中克隆表达蜜蜂螺原体Spiroplasma melliferum CH-1中可能与致病相关的几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)基因chid,并测定其部分酶学性质,为进一步研究该基因在蜜蜂螺原体致病过程中的作用奠定基础。[方法]利用Overlap Extension PCR(OE-PCR)定点突变技术,在引物设计时插入目的突变,通过3次PCR获得突变后的目的片段,测序验证后构建重组质粒p ETchid,挑取BLchid表达菌株。IPTG诱导表达目的蛋白,NTA-Ni2+柱纯化,Western blotting验证,紫外分光光度法测定其酶活力和酶学性质。[结果]DNA测序结果表明:chid基因中待突变位点已由TGA突变为TGG,成功克隆到chid基因全长,并得到外源表达的完整目的蛋白。该基因编码区为672 bp,编码的氨基酸构成相对分子质量约28×103的蛋白,同源性比较发现其与S.melliferum KC3/BC3/IPMB4A菌株序列相似性为97%。测得外源表达的该酶活力最高可达10.14 U·m L-1,最适温度为50℃左右,最适p H值为7.0~7.5。[结论]首次克隆了螺原体几丁质脱乙酰酶基因chid,并得到具有活性的外源目的蛋白,为后续研究螺原体与宿主蜜蜂的相互作用及其致病机制提供了重要信息。 相似文献
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《山西农业科学》2018,(12)
以中花6号和徐花13号为亲本构建的含有240个家系的花生重组自交系(Recombinant inbred lines,RIL)为研究材料,利用高效液相色谱法测定了该RIL群体的白藜芦醇含量,对其遗传变异与分布特征进行了分析,采用主基因+多基因遗传分离分析法,进行花生白藜芦醇含量的遗传模型分析,旨在为该RIL群体后续研究利用提供参考。结果表明,RIL群体的白藜芦醇含量存在广泛变异,表现超亲分离现象,其分布近似为正态分布,呈现数量性状连续变异的典型分布特征;运用主基因+多基因遗传模型分析结果表明,白藜芦醇的遗传符合C-0遗传模型(加性-显性-多基因模型),为花生白藜芦醇遗传的最佳遗传模型,受多基因控制,且多基因间存在加性-显性效应。 相似文献
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【目的】克隆麻鸭磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPx4)并在大肠杆菌中表达,分析其酶学特性,为研究GPx4功能及其在羟基脂肪酸形成过程中的调节机制打下基础。【方法】采用RT-PCR克隆麻鸭GPx4(DGPx4)的编码基因,利用定点突变的方法构建半胱氨酸突变体DGPx4表达载体pMBP-DGPx4(48Sec→Cys),并在大肠杆菌中通过添加His标签进行可溶性表达,经Ni-NTA亲和层析和离子交换层析纯化得到融合蛋白DGPx4;采用总谷胱甘肽过氧化物酶活性检测试剂盒检测DGPx4活力以研究其酶学性质。【结果】克隆获得的DGPx4基因编码序列全长516 bp,编码172个氨基酸,编码蛋白分子量约20 k D,理论等电点(p I)为8.9。构建的突变体基因原核表达载体pMBP-DGPx4(48Sec→Cys)可在大肠杆菌中成功诱导表达获得融合蛋白DGPx4,经Ni-NTA亲和层析和离子交换层析即获得高纯度的DGPx4。以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)为底物时,DGPx4的最适反应温度为32℃,最适pH为8.0,对NaCl浓度较敏感;Cu2+和Ni2+对DGPx4活力有较高的促进作用,Mg2+和Mn2+对DGPx4活力有一定的抑制作用,Ca2+和Zn2+对DGPx4活力则无明显的促进或抑制作用。【结论】从鸭肝细胞中克隆获得的DGPx4基因序列经定点突变后可在原核细胞中高效表达,且纯化后的高纯度融合蛋白DGPx4具有GPx4活力,能在抗脂质氧化过程中发挥作用。 相似文献
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《东北农业大学学报》2015,(8)
为研究粉红粘帚菌(Clonostachys rosea)生防机制并获得生物防治相关基因,文章利用RT-PCR方法克隆粉红粘帚菌1个几丁质酶基因T-ech42,对该基因进行生物信息学分析,并在大肠杆菌原核表达系统中进行外源表达。该基因长度为1 263 bp,编码420个氨基酸。推导T-ech42氨基酸序列以及蛋白质结构的生物信息学分析表明,该蛋白等电点为5.85,理论分子质量为45.13 ku,N端含信号肽,长度为20个氨基酸;T-ech42属于糖基水解酶18家族内切几丁质酶,包含SIGGW底物结合位点和FDGIDXDWE活性位点。将该基因构建到原核表达载体p ET-22b(+)上,转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,经终浓度1 mmol·L-1的IPTG诱导4 h后,可见酶蛋白活性表达。 相似文献
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枯草芽胞杆菌果糖基转移酶基因的克隆及其序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
利用自行设计的引物,在枯草芽孢杆菌基因组内获得果糖基转移酶基因,基因和相应蛋白序列分析发现.该基因共1 422个碱基,编码473个氨基酸,与GenBank注册的sacB基因序列有89%的相似性;全长序列有152突变碱基,共造成18个氨基酸的错义突变,但没引起酶保守活性位点的关键氨基酸突变.这结果为后期表达特异连接α1→2糖苷键的果糖基转移酶或者该基因的定点突变打下基础. 相似文献
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为了鉴定猪链球菌9型噬菌体裂解酶Ply5218的最小活性功能域及关键氨基酸位点,利用PCR技术对全长裂解酶Ply5218进行截短并对可能与活性相关的关键氨基酸位点进行定点突变,研究截短与突变后各个蛋白的活性并与全长蛋白活性对比。结果显示,截短片段Ply5218_(1-147)可在平板上形成裂菌圈,仍保持裂菌活性,而比该片段更短的截短片段则失去裂菌活性,推测Ply5218_(1-147)为Ply5218的最小活性相关功能域;第8、58、136和142位点的氨基酸突变后,裂菌活性部分降低,第34和144位点的氨基酸突变后,则彻底失去裂菌活性。研究结果为深入揭示Ply5218的裂菌机制和进一步改造裂解酶提供了基础数据。 相似文献
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【目的】通过易错PCR技术克隆一种新的Cry1Ab13基因,以利用Cry类Bt基因提高作物抗虫性,丰富基因资源。【方法】利用易错PCR技术对苏云金芽孢杆菌Cry1Ab13基因进行随机诱变,构建突变体文库,筛选获得突变株Cry1Ab13-1,将该基因构建原核重组表达载体后转化到大肠杆菌中进行异源表达,并利用表达的目的蛋白进行抗虫鉴定。【结果】序列分析表明,突变株Cry1Ab13-1基因序列全长2 036bp,与原始碱基序列的一致性为97.79%,有2个碱基发生突变,导致该基因编码的氨基酸序列中有2个氨基酸改变,分别是第130位由脯氨酸变成丝氨酸,第383位由丝氨酸变成苏氨酸;改变后的氨基酸序列与原始氨基酸序列一致性为96.97%。在线分析表明,该基因与已知过敏源的序列同源性低于35%,不存在致敏性。SDS-PAGE电泳分析表明,表达蛋白分子质量大小为79.5ku,与预期结果相符。抗虫鉴定表明,处理72h时表达的目的蛋白对小菜蛾(Plutella xyllostella)幼虫的致死率达87.88%,明显高于未突变基因对照组的幼虫死亡率;对亚洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)幼虫的致死率达81.11%,而且存活的亚洲玉米螟幼虫的生长发育受到明显抑制。【结论】成功克隆了Cry1Ab13-1抗虫基因,且该基因对小菜蛾幼虫和亚洲玉米螟幼虫均具有高效的杀虫活性。 相似文献
16.
以‘赤霞珠’(Cabernet sauvignon)和‘蛇龙珠’(‘Cabernet gernischt’)葡萄果实为试材,在葡萄浆果生长期设置0(对照)、0.05、0.1、0.5mg·L~(-1)的24-表油菜素内酯(EBR)处理,研究不同质量浓度的24-表油菜素内酯处理对葡萄果皮白藜芦醇(Res)质量分数的影响,同时探讨葡萄果皮中白藜芦醇质量分数与苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸4-羟基化酶(C4H)、4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)活性的关系。结果表明,在葡萄果实生长发育过程中,‘赤霞珠’和‘蛇龙珠’果皮中白藜芦醇质量分数变化出现2次高峰,分别在花后35d和花后80d。PAL、C4H、4CL活性变化与果皮中白藜芦醇质量分数变化相一致。不同质量浓度的EBR处理对葡萄白藜芦醇有显著的诱导效果,其中以0.1mg·L~(-1) EBR诱导效果最好。由此推断,适宜质量浓度的EBR处理可能激活相关酶的活性,进一步提高葡萄白藜芦醇质量分数。 相似文献
17.
《延边大学农学学报》2015,(3)
为将玉米高蛋氨酸蛋白基因在原核细胞中加以表达、培育高蛋氨酸水平的益生菌并用于提高动物饲料的蛋氨酸含量,本研究采用PCR克隆的方法,从玉米自交系B73中克隆出目的基因dzs18。结果表明:目标DNA序列长度729bp;目的基因编码由211个氨基酸组成的富含蛋氨酸的18kDδ-zein,其蛋氨酸残基数(50)占总氨基酸数量的23.7%。该蛋白质氨基酸序列的中部,即第75个氨基酸到第167个氨基酸之间,存在1个由93个氨基酸序列构成的蛋氨酸高密区,蛋氨酸残基数(41)所占比率为44.1%。利用所克隆的B73-dzs18,成功构建出dzs18基因的原核表达载体pGEX4T1-dzs18;目的基因正确插入到载体中GST标签基因的下游;序列测定证明,目的基因dzs18与GST标签基因构成具有无移码突变、连读阅读的GST-dzs18融合基因。 相似文献
18.
枯草芽孢杆菌中有2个编码谷氨酸脱氢酶(GDH)的基因:rocG基因和gudB基因。其中Bacillus subtilis 168菌株的rocG基因编码有活性的GDH,而gudB基因编码没有活性的GDH。敲除168菌株的rocG基因后,gudB基因会自发突变为gudB1基因,后者编码有活性的GDH(gudB1-GDH)。为了研究gudB1-GDH在代谢中的作用及调控机制,构建了pMUTin4-rocG插入突变重组质粒,将其转化至B.subtilis 168,成功获得了1株rocG失活突变株BS-△rocG。对BS-△rocG和野生株的生长情况及GDH酶活进行了比较,发现BS-△rocG生长情况和野生株相当,但其GDH酶活为4.641U/mg蛋白,高于野生株的3.042U/mg蛋白。由此推测BS-△rocG中,gudB可能自发突变为gudB1,从而能够编码有活性的GDH,这一结果为研究枯草芽孢杆菌gudB1-GDH在代谢中的作用及调控机制奠定了基础。 相似文献
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《江苏农业学报》2016,(2)
为了对鲤鱼(Cyprinus carpio)2种脂蛋白脂肪酶(LPL1、LPL2)基因进行c DNA克隆以及表达和酶活性分析,测定了鲤鱼2种脂蛋白脂肪酶基因的组织表达特征,对这2种基因进行了原核表达,采用对硝基苯酚法比较了2种LPL的酶活性。克隆结果表明,鲤鱼LPL1和LPL2基因的开放阅读框分别为1 524 bp和1 503 bp,分别编码507个和500个氨基酸,氨基酸相似性为45.51%,LPL2氨基酸功能位点由~(83)N突变至~(83)K。实时荧光定量PCR结果表明:LPL1和LPL2均在肝脏中表达量最高,其次在心脏、脂肪、肌肉、脑、肾中,前肠表达量最低,在所有组织(器官)中LPL1的表达量比LPL2高。构建的原核表达载体LPLs-p EASY(E2),经IPTG诱导,在Transetta(DE3)细胞中表达了分子量分别为5.55×10~4、5.35×10~4的融合蛋白LPL1和LPL2。酶活性测定结果表明:LPL1和LPL2酶活性最适温度均为为35℃,最适p H均为8.0。LPL1酶活性高于LPL2,推测可能与LPL2的~(83)N位点突变所导致的N-糖基化位点缺失有关。〗 相似文献
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二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)是花色素苷代谢途径中的关键酶之一.本研究利用PCR技术将观赏向日葵DFR底物结合区敲除,并将该区域中134位保守氨基酸天冬酰胺定点突变为天门冬氨酸和亮氨酸,最后获得已敲除底物结合区的基因KODFR以及定点突变的基因N134D和N134L,并成功构建KODFR、N134D和N134L基因的植物表达载体pCAM-KODFR、pCAM-N134D和pCAM-N134L. 相似文献