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1.
[目的]建立1种快速、灵敏、特异的检测猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。[方法]根据JEV E基因序列的保守区6个位点设计了4条特异性LAMP引物,以JEV阳性样品RNA为模板进行一步法扩增,并对反应条件和反应体系进行了优化。[结果]该方法具有较高的灵敏度,其检测极限为0.5 pg;特异性试验表明其具有较高的特异性,对其他病毒性病原体均无扩增反应。与RT-Nested-PCR相比,2种方法检出率的符合率为90.9%。反应结束后可以通过添加化学发光剂进行可视化观察,大大缩短了检测时间。该方法无需特殊仪器,只需在水浴锅中进行,是一种适于基层的简便、灵敏、快速的猪JE的检测方法。[结论]成功建立了猪流行性乙型脑炎RT-LAMP方法,并在临床上进行了初步应用。 相似文献
2.
【目的】建立特异性好、灵敏度高的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)快速检测方法，为非洲猪瘟的实时实地快速检测提供参考。【方法】通过对非洲猪瘟病毒多种基因型66个毒株的E165R基因多序列比对，选取相对保守区域设计LAMP引物，并对反应条件及反应体系进行优化。在获得的最优反应条件及体系下考察方法的检测特异性和灵敏性。【结果】选取的LAMP检测靶标235 bp(29～264 bp)在不同基因型ASFV毒株中保守性较好，序列相似度达94.46%～100%;LAMP反应的最佳温度为64℃、时间为35 min、Mg2+浓度为8 mmol/L、内外引物比为8︰1、Bst DNA聚合酶量为16 U。建立的ASFV环介导等温扩增检测方法最低检测限为50 copies/μL,较常规PCR检测提高1个数量级，且35 min即可完成扩增反应。LAMP检测方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸道综合症病毒(PR... 相似文献
3.
为建立一种快速检测虾肝肠胞虫(EHP)的环介导等温扩增法(LAMP),根据Gen Bank中登录的EHP-SSU基因序列设计6条特异性引物,成功建立了EHP-LAMP检测方法。该方法检出限为3.71个质粒拷贝/μL,并且与虾其他常见病毒病的病原(WSSV、IHHNV、CMNV)均无交叉反应。采用LAMP方法和常规PCR方法对30份具有典型EHP感染症状的对虾样品进行检测,结果显示:LAMP和PCR方法的阳性检出率均为100%。结果表明,建立的EHP-LAMP方法具有高灵敏度、高特异性、高准确度的优点,为对虾肝肠胞虫的快速早期诊断奠定基础。 相似文献
4.
根据GenBank上登录的日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)与猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)参考基因序列,设计合成2对特异性引物,在建立优化单项PCR检测方法的基础上,建立了PPV-JEV复合PCR检测方法,可扩增出预期的238 bp和152 bp特异性片段。该方法敏感性高、稳定性好、特异性强,临床样品检测结果与单项PCR检测结果符合率100%,该方法适合JEV和PPV的联合检测和鉴别诊断。 相似文献
5.
《江苏农业学报》2017,(6)
为实现番鸭呼肠孤病毒的快速检测,本研究根据Gen Bank中公布的番鸭呼肠孤病毒σC蛋白基因的高度保守序列设计了4条引物,通过优化反应体系中各组分的浓度、反应时间和温度,建立了一种灵敏、便捷的RT-LAMP扩增方法。然后以鸭常见病毒基因组为模板,开展特异性检测,最后通过添加SYBR Green I荧光染料完成可视化LAMP检测方法的建立。结果显示:25μl LAMP反应体系,镁离子5×10-5mmol,d NTP 1.25×10-5mmol,Bst DNA聚合酶8 U,F3/B3 5×10-6μmol,FIP/BIP 3×10-5μmol,62℃,45 min为最优反应条件;在最佳条件下甜菜碱对反应体系影响不明显;对临床样品的阳性检出率与常规RT-PCR检测方法一致,但灵敏度高于PCR方法,最低检测限为10 pg,检测结果可直接通过肉眼观察来判断。该方法为番鸭呼肠孤病毒的可视化RT-LAMP快速检测试剂盒研制奠定了基础。 相似文献
6.
《山东农业科学》2017,(7)
本研究根据番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)保守N基因(Gen Bank登录号:13YV639)设计一对特异性引物,通过优化反应条件和反应体系,构建了TZSV的SYBR Green RT-qPCR检测方法。该方法稳定可靠,组内和组间的变异系数都小于2%;标准曲线的斜率和相关系数分别为-3.39和0.996,扩增效率为97.44%;最低能检测到1.07×10~4copies/μL的阳性质粒,灵敏度为常规PCR的1 000倍。同时利用构建的RT-qPCR方法检测TSWV、TNSa V、PCSV和TZSV四种病毒,只有TZSV有特异扩增曲线,表明该方法特异性良好。本研究构建的RT-qPCR方法能够为TZSV的早期预警与动态监测提供可靠的技术支撑。 相似文献
7.
猪瘟病毒RT-LAMP-LFD检测方法的建立与应用 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】建立一种新型的、能在基层场地进行实时便捷诊断的猪瘟病毒检测方法。【方法】环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)-横向流动试纸条技术(Lateral flow dipstick,LFD)相结合,针对猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)NS5B基因设计一套特异性引物及生物素标记探针,结合异硫氰酸荧光素标记的扩增产物,建立RT-LAMP-LFD检测方法。【结果】所建立的方法能够特异地检测出CSFV的存在,检测PRRSV、JEV、PCV-2等其他病毒均为阴性;所建立的CSFV-RT-LAMP方法对RNA的最低检测限为50 pg;反应快速,整个扩增反应可在1 h内完成;操作简单,不需要PCR仪等复杂的仪器,结果可经肉眼观察。【结论】应用RTLAMP-LFD检测CSFV特异性强、灵敏度高,并且操作安全、简便、快捷,可以满足基层检疫的需要。 相似文献
8.
复合RT-PCR检测猪乙脑病毒和猪流感病毒方法的建立 总被引：4，自引：0，他引：4
根据GenBank上已发表的猪乙脑病毒(JEV)的E基因序列和猪流感病毒(SIV)的NP基因序列,设计合成了2对特异引物,分别建立了JEV和SIV的单项RT-PCR诊断方法,通过对扩增条件的筛选,最终成功地建立了JEV和SIV的复合RT-PCR诊断方法,利用一次RT-PCR反应,即可同时扩增JEV的349 bp和SIV 155 bp的特异性片段,而猪瘟病毒(HCV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、正常细胞(PK-15)核酸扩增结果为阴性,对JEV和SIV的最低检出量分别为100和10 pg的cDNA. 该方法适合对JEV和SIV的联合检测和鉴别诊断. 相似文献
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棉花皱叶病毒(Cotton leaf crumple virus,CLCrV)是危害棉花的重要病毒之一,属中国进境检疫性植物病毒,本研究根据其DNA-B基因序列设计LAMP特异性引物,通过试验建立CLCrV的LAMP检测方法。该方法检测快速,15min即可检测到扩增曲线;特异性强,可有效区分同属的CLCrV、棉花曲叶病毒(CLCuV)、非洲木薯花叶病毒(ACMV)及番茄黄化曲叶病毒(TYLCV);灵敏度高,可检测到约43fg/μL的总DNA,比普通PCR灵敏度高1 000倍;并可通过肉眼观察浊度或颜色反应进行结果判断。该方法适用于现场CLCrV的快速检测。 相似文献
10.
采用逆转录环介导等温扩增技术（RT\|LAMP）,建立一种便捷、灵敏的大蒜X病毒（Garlic virus X, GarVX）的快速检测方法。根据GarVX ORF4序列的保守区设计6条特异性引物,分别识别该保守区的8个位点,在反转录酶和Bst DNA聚合酶的作用下对靶序列进行扩增反应。通过条件优化,在65℃恒温条件下温浴60 min可成功检测GarVX。特异性检测结果表明,该方法可特异性检出GarVX,对大蒜A病毒（Garlic virus A, GarVA）、大蒜D病毒（Garlic virus D, GarVD）、大蒜E病毒（Garlic virus E, GarVE）等的检测均为阴性,且检测灵敏度高,最低检出限为5 pg·μL-1,是RT\|PCR方法的10倍。试验结果表明,RT\|LAMP检测方法可快速、特异、灵敏地检测GarVX,并适合现场快速检测。 相似文献
11.
《江苏农业科学》2017,(22)
为建立快速诊断猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)的方法和耐药情况,根据Gen Bank中的APP apx IVA基因,设计合成2对引物,通过环介导等温扩增技术(LAMP)扩增条件的优化,建立了APP LAMP诊断方法,同时对分离到的APP进行耐药性分析。结果显示,建立的LAMP诊断方法最低核酸检测量为2 pg/μL,对猪源大肠杆菌、猪源沙门氏菌、猪源支原体、副猪嗜血杆菌、猪源多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性,扩增反应30 min内完成,结果肉眼可见。分离得到的31株APP,耐药性较强。结果表明,建立的方法可满足基层现场快速检测需要,对分离得到的31株APP耐药性分析表明,APP耐药性较严重。 相似文献
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猪细环病毒(Torque teno sus virus,TTSu V)是一种无囊膜,单链的DNA病毒,存在猪细环病毒1型和猪细环病毒2型2个亚型。为建立一种新型快速的TTSu V1检测方法。针对TTSu V1保守的非编码区域(untranslated regions,UTR)设计2对LAMP引物,并对反应体系和反应条件进行了优化调整,建立了TTSu V1 LAMP检测方法。结果表明该方法最佳反应条件为62℃1 h,病毒最低检出限可达9.2 copies/μL,特异性良好。LAMP反应是一种集特异性强,灵敏度高,反应速度快于一体的的基因检测方法,有望成为快速检测TTSu V1的手段之一。 相似文献
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桃拉综合征病毒的环介导等温扩增联合横向流动试纸条(LAMP-LFD)检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus, TSV)是威胁虾类养殖业的主要病毒之一。本试验建立了一种快速检测TSV的环介导等温扩增联合横向流动试纸条(LAMP-LFD)方法,并与荧光定量PCR(qPCR)进行了对比。基于TSV的衣壳蛋白VP2核酸序列,设计3对特异性引物(外引物:FIP/BIP,内引物:F3/B3,环引物:LF/LB),进行LAMP反应体系的优化。其中引物LF以BIO标记,LB以FAM标记,用于横向流动试纸条(LFD)的检测。结果表明:LAMP最佳反应可在63℃恒温条件下40 min内完成。整个扩增反应到LFD结果判定可在45 min内完成。LAMP-LFD可特异性检出TSV特异性片段,未与其它病毒和细菌发生交叉反应,且其检测限为22.9 fg。与qPCR相比,本研究所建立的LAMP-LFD检测体系虽然检测限高于qPCR 10倍,但比qPCR检测时间缩短近1 h,且LAMP-LFD特异性强、操作简单,无需特殊仪器设备,可快捷、方便地检测出TSV,满足TSV基层快速检测的需要。 相似文献
15.
《福建农业学报》2021,(2)
【目的】建立沙门氏菌可视化环介导恒温扩增体系(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),并在快速检测蔬菜栽培土壤中应用,为蔬菜栽培土壤中沙门氏菌的防控提供技术支撑。【方法】根据沙门氏菌特有侵袭蛋白A (invA)基因序列设计可视化LAMP检测引物,并优化LAMP反应体系和反应条件,通过特异性试验、灵敏度试验和人工污染试验对LAMP检测方法进行验证,最后与国标检测方法对比检测蔬菜栽培土壤中沙门氏菌来验证该方法的准确性。【结果】优化后可视化LAMP检测方法,特异性试验结果显示除沙门氏菌的LAMP反应为阳性外,其余6个非沙门氏菌菌株的LAMP反应均为阴性,表明本LAMP检测方法具有良好的特异性;灵敏度试验结果显示本LAMP检测方法最低可以检测到7 CFU/25μL的沙门氏菌DNA;人工污染试验结果显示本LAMP检测方法灵敏度达4×10~2 CFU·g~(-1),与国标检测方法对比检测蔬菜栽培土壤中沙门氏菌具有相同的准确性,但检测时间从5～7 d缩短至8 h内。【结论】本研究建立了快速、准确、灵敏的可视化恒温扩增体系,可以应用于蔬菜栽培土壤中沙门氏菌的快速检测。 相似文献
16.
猪细小病毒LAMP检测方法的建立 总被引：5，自引：0，他引：5
【目的】建立一种快速、敏感、特异的检测猪细小病毒(PPV)环介导等温扩增(LAMP)方法,为诊断猪细小病毒提供准确可靠工具。【方法】根据GenBank公布的PPV序列,在其保守序列区域设计了多套LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测反应进程并筛选最佳引物、反应条件,建立了对PPV病毒DNA进行特异扩增的 LAMP检测方法,并可通过加入SYBR Green I肉眼判断结果。【结果】该方法在63℃恒温下作用45 min,PPV病毒DNA获得了高效率的特异性扩增;其检出限量为0.23 TCID50,敏感性高;在反应结束后加入SYBR Green I肉眼判断结果,与Real Time Turbidimeter LA-320仪监测结果一致。通过对20份临床样品的LAMP检测与免疫荧光鉴定、PCR方法比对,符合率均为20/20。【结论】本研究建立的PPV LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏,操作简单、设备要求低的特点,适合用于临床PPV快速检测。 相似文献
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《山东农业科学》2021,(3)
为建立猪圆环病毒1型(PCV1)环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为现场诊断提供技术支持,本试验根据GenBank公布的PCV1全基因组序列,在其保守区设计了4条特异性LAMP引物,并通过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验以及临床样本检测,首次建立了PCV1的LAMP检测方法。结果表明,62℃水浴60 min为最佳反应条件;LAMP的检出限为1×10~1 copies/μL,普通PCR最低检测限为1×10~3 copies/μL;对猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)进行扩增,结果显示为阴性;应用该方法对103个临床疑似病料进行检测,阳性率为34.0%(35例),普通PCR阳性率为29.1%(30例),两种检测方法符合率为89.5%。本试验为PCV1临床检测提供了一种特异、快速、成本低廉的方法。 相似文献