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1.
为研究广谱抗环斑病毒（PRSV）海南株系转基因番木瓜育种方案,采集海南番木瓜各主要种植区的PRSV株系,以外壳蛋白（CP）、辅助成分－蛋白酶（HC-Pro）和复制酶（Nib）基因作为靶标基因,通过序列比对和运用Clustalx软件分析,得到干扰基因的保守区域和挑选出海南PRSV典型株系的代表样品。以pUCCRNAi为骨架质粒,利用代表样品的CP、NIb、Hc-Pro基因片断保守序列构建RNAi发夹结构,将发夹结构导入pCAMBIA2300-35S-OCS植物表达载体,构建出抗PRSV植物表达载体pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS、pCAMBIA230035S-Hc-Pro-RNAi-OCS、pCAMBIA2300-35S-NIb-RNAi-OCS。实验将PRSV不同株系保守序列的分析与RNAi的高效抗病设计理念相结合,可用于创造高效、广谱抗PRSV病毒病的新种质。 相似文献
2.
以植物总RNA提取试剂盒提取的高纯度的总RNA为模板,使用Oligo dT-Adaptor和Random9引物合成了番木瓜环斑病病毒海南分离物(PRSV HN-2)的cDNA第一链,基于已报道的PRSV全长基因组序列,设计合成了一对引物,一步法RT-PCR扩增出PRSV海南分离物全长基因组cDNA。为了验证获得的全长基因组cDNA的正确性,并以扩增出的全长cDNA为模板,将PRSV全长基因组分成A、B 2个大片段进行扩增,应用T载体进行克隆和测序以验证所获得的全长基因组cDNA序列的正确性。测序结果显示,该cDNA序列与国内外报道的PRSV各分离物全长核苷酸序列的相似性很高,表明本文建立的一步法RT-PCR扩增PRSV全长基因组cDNA的方法正确、可行。 相似文献
3.
利用p CAMBIA3300载体为背景,构建PRSV CP-VPg嵌合型植物表达干扰载体p Cambia-hp RNA-CV,通过花粉管通道法将PRSV CP-VPg嵌合型植物表达载体遗传转化番木瓜,并将获得的转化番木瓜种子依次进行除草剂(PPT)筛选、PCR检测。结果表明:获得转基因番木瓜植株5株,且RT-PCR实验证明了目标片段在转基因株系中得到表达。采用人工摩擦接种法对转基因番木瓜株系进行攻毒实验,结果显示转基因番木瓜植株对PRSV病毒表现出抗病特性,说明hp RNA-CV成功的干扰了病毒基因的复制。该研究结果为番木瓜抗PRSV育种提供了一种有效的研究手段。 相似文献
4.
分子生物学育种是目前防治番木瓜环斑病毒(PRSV)最有效的方法。早期转基因番木瓜抗病毒的策略是根据"致病菌衍生的抗病性"(PDR)原理,将病毒来源的基因全长序列,转入番木瓜并获得抗性。PDR策略最主要特点依赖于靶目标病毒基因序列相似性,不能有效解决海南的番木瓜环斑病毒遗传多样性复杂的株系。本研究着眼于创制广谱的抗PRSV新策略,用最新的CRISPR/FnCas9基因编辑技术和Golden Gate载体构建系统,依据不同PRSV株系的保守序列分析结果,将5个sgRNA(2个CP sgRNA,2个Nib sgRNA和1个HC-Pro sgRNA)串联在一个载体上,实现一个载体可识别剪切5个位点,从而达到广谱抗PRSV的效果,应对海南地区PRSV株系复杂的问题。目前载体已经进行了测序验证,并在番木瓜上进行了叶片局部瞬时表达,初步表现出对PRSV的抑制效果,这为获得广谱抗番木瓜环斑病毒的番木瓜品种奠定良好基础。 相似文献
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酸性蛋白酶pepB基因植物表达载体的构建及在玉米中的转化 总被引：1，自引：0，他引：1
以黑曲霉基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增了酸性蛋白酶pepB基因序列,并将其克隆到pMD18-T Vector上,对重组子进行了PCR检测和限制性内切酶分析并测序.DNA序列分析表明:克隆片段长为1340bp,与已发表的pepB基因序列同源性达99.85%.将pepB基因片段插入到带有耐盐基因的表达载体pCAMBIA1301-BADH上,构建了无抗生素选择标记的重组质粒pB-pepB-35S,从而得到了植物表达载体,该载体利用耐盐基因BADH替代抗生素基因作为筛选标记.通过花粉管通道法将其导入玉米自交系,获得了转基因植株,并得到了转化植株的种子. 相似文献
7.
为了从分子水平上解析番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus,PRSV）的致病机理,寻找广谱、有效的抗病毒新策略,培育具有应用前景的抗病新品种,利用RT-PCR和快速cDNA末端扩增技术（RACE）对引起番木瓜环斑病毒病的PRSV海南海口分离物（PRSV-HN2）的基因组cDNA进行了全序列测定。PRSV-HN2全长cDNA包含10 326 nt（不包括3′端的polyA,GenBank登录号为KF791028）,能编码3 346个氨基酸。对PRSV-HN2基因组核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行了结构和功能分析,结果表明,其与其它23个PRSV分离物的核酸序列相似度达81％~91％,氨基酸相似度为88％~94％。利用酵母同源重组系统成功构建其侵染性克隆载体并通过农杆菌转化与侵染,最终获得其侵染性克隆。这为在分子水平上研究PRSV遗传变异、侵染及致病机理奠定理论基础。 相似文献
8.
利用马铃薯Y病毒属的简并引物对3个海南感病番木瓜植株的叶片进行RT-PCR检测,并将其克隆到T载体上进行测序和BLAST分析。结果表明：均获得了大小约1 700 bp的特异性条带,与预期大小基本一致;所得序列与GenBank中收录的番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV）基因序列相似性达到88％～96％,序列包含部分NIb蛋白基因、外壳蛋白（CP）基因和3′端非编码区。这是首次报道在中国海南地区发现番木瓜感染了PLDMV。但是仅基于PLDMV外壳蛋白基因的系统进化分析结果还不足以证明在海南发现的PLDMV与其他地区的某一PLDMV株系为同一进化簇。 相似文献
9.
利用同源克隆方法从大豆中克隆到一个耐盐基因HAL3,命名为GmHAL3a,组织表达分析发现GmHAL3a基因在大豆根中表达量最高,荚中次之,叶中表达量最低;非生物胁迫实验表明该基因受NaCl、LiCl和山梨醇诱导表达;通过生物信息学的方法分析发现该基因具有2个跨膜螺旋区域,可能定位于叶绿体中;同源序列比对证实该基因氨基酸序列具有与其他物种相似的保守位点:黄素单核苷酸(FMN)结合位点和磷酸泛酰半胱氨酸(PPC)脱羧酶活性位点。同时扩增了这个基因的2个干扰片段,用Gateway技术将扩增的片段通过BP反应连接到入门载体pDONR221,测序后又通过LR反应分别将目的片段插入到RNAi载体pB7GWIWG2(Ⅱ),再转入根癌农杆菌EHA105中。这2个载体的构建对于进一步研究大豆中GmHAL3a基因的功能具有重要意义。 相似文献
10.
提取面包酵母基因组DNA,用无机焦磷酸化酶(PPase)基因特异引物通过PCR扩增出864bp的片段,并将该片段克隆至pMD18-T上。序列分析结果表明,该克隆序列与GeneBank上的PPase基因序列同源性达到100%。进一步将叶肉细胞特异性启动子rbcS和PPase基因克隆至植物表达载体pCBI上,构建了由rbcS启动子调控的PPase基因植物表达载体pCBIPR。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105中,为农杆菌介导的PPase基因对植物的遗传转化奠定基础。 相似文献
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CHEN Zhuanzhuan # LI Xianfeng # ZHONG Min GE Jiaqi FAN Xiaolei ZHANG Changquan LIU Qiaoquan 《中国水稻科学》2019,33(6):513-522
【Objective】Gelatinization temperature (GT) is one of the key physicochemical properties in rice quality, which is mainly regulated by ALK (SSII-3) gene. In general, there are two ALK alleles among indica cultivars. To detect their functional differentiation in indica rice,【Method】Zhenshan 97B (a high GT variety carrying ALKc allele) and Longtefu B (a low GT variety carrying ALKb allele), were used as receptors for the generation of transgenic rice with down-regulation of ALK expression by RNA interference (RNAi).【Result】Down-regulation of ALK gene significantly decreased the GT of the transgenic lines. Due to the difference of original GT between the two receptors, the GT of transgenic rice lines derived from Zhenshan 97B (a high GT variety) decreased significantly, but it is slightly decreased in transgenic plants derived from Longtefu B (a low GT variety). The differential scanning calorimetry (DSC) results showed that the initial temperature of RNAi transgenic rice was significantly lower than the corresponding control and the transgenic lines were gelatinized in advance. The peak value of GT(Tp) in RNAi rice grains was significantly lower than that of the control under Zhenshan 97B background. However, Tp of RNAi rice grains under Longtefu B background was significantly lower than the control to a lesser extent. Also, down-regulation of ALK expression had a significant effect on rice physical-chemical characteristics. An increase of apparent amylose content in RNAi transgenic plants was detected due to the decreased expression of ALK gene. Besides, the pasting properties showed that down-regulation of ALK gene had obvious effects on peak viscosity and breakdown value, improving the taste of the transgenic rice. The gel consistency was significantly different among Zhenshan 97B RNAi lines and their parents, but no difference was found in Longtefu-derived transgenic lines.【Conclusion】RNA interference to ALK allele expression had a significant effect on rice quality, especially the gelatinization characters. Down-regulated expression level of ALKc allele would cause larger variation of physical-chemical characteristics between transgenic rice and their parent than that of ALKb allele. 相似文献
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【目的】稻米糊化温度是影响稻米品质的重要指标，该性状受主效基因ALK/SSII-3调控，ALK基因具有多个复等位基因，本研究旨在通过RNAi技术明确籼稻亚种中两个不同ALK等位基因的效应。【方法】以分别含有ALKc和ALKb等位基因的高糊化温度品种珍汕97B和低糊化温度品种龙特甫B为试验材料，使用RNAi技术构建ALK表达下调的转基因株系，通过对其稻米理化品质的测定来明确不同等位基因表达下调对稻米品质的影响。【结果】对不同转基因水稻目的基因的表达分析显示本研究中转基因株系的ALK基因受到了不同程度的干扰。重点分析了不同RNAi株系稻米的糊化温度，结果表明珍汕97B的RNAi转基因稻米的糊化温度极显著降低，而在低糊化温度品种龙特甫B背景中下调表达ALK基因后对糊化温度的影响较小；转基因株系与未转化亲本相比，米粉的起始糊化温度都显著降低，表现为提前糊化；在珍汕97B背景下干扰系的峰值温度与未转化亲本相比极显著降低，而在龙特甫背景下米粉的峰值温度与未转化对照相比显著降低。对不同转基因系的理化品质分析表明，ALK下调表达植株稻米的表观直链淀粉含量显著增加，下调表达ALK后会引起米粉峰值黏度和崩解值的改变。高糊化温度品种珍汕97B干扰系与未转化对照相比胶稠度呈现极显著性差异，而低糊化温度品种龙特甫干扰系的胶稠度与未转化对照相比没有差异。【结论】下调表达ALK等位基因对稻米理化品质产生显著影响，并且干扰不同等位基因的效应存在明显差异，即籼稻中的两个ALK等位基因的效应存在显著差异。 相似文献
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应用Sos恢复系统(Sos recruitment system)筛选可能与番木瓜环斑病毒CI(Cylindrical inclusion protein,圆柱形内含体蛋白)相互作用的寄主蛋白因子,通过营养缺陷、温度敏感筛选、回转验证、序列测定和同源比对分析,获得1种候选的互作寄主蛋白,该蛋白与植物的叶绿体延伸因子Tu(Elongation factor Tu,EF-Tu)具有较高的相似性,并对其在番木瓜环斑病毒(Papaya Ringspot Virus,PRSV)致病与植物防御过程中的功能进行初步分析。 相似文献
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PEG模拟干旱胁迫条件下E3连接酶GmPLR-2 基因在大豆根茎叶中呈上调表达，推测其可能参与大豆抗
旱调节。本研究克隆GmPLR-2 基因，构建植物过表达载体pCAMBIA3301-GmPLR-2、RNA干扰表达载体pCAM⁃
BIA3301-GmPLR-2-RNAi并转化到吉农38中，对T2转基因植株进行分子检测，连续7 d不浇水后测定转基因叶片
中相关生理生化指标。结果表明：共获得T2过表达阳性植株12株，RNA干扰阳性植株11株。干旱胁迫7 d后过表
达植株中相对含水率、POD活性、SOD活性、Pro含量均高于未转化植株，而RNA干扰植株中则低于未转化植株；另
一方面过表达植株中相对电导率、MDA含量均低于未转化植株而RNA干扰植株中含量则高于未转化植株，且差异
极显著，说明GmPLR-2 基因的表达与大豆中相关抗旱指标的变化有关。 相似文献
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Down-Regulated Expression of RACK1 Gene by RNA Interference Enhances Drought Tolerance in Rice 总被引：2，自引：0，他引：2
The receptor for activated C-kinase 1 (RACK1) is a highly conserved scaffold protein with versatile functions, and plays important roles in the regulation of plant growth and development. Transgenic rice plants, in which the expression of RACK1 gene was inhibited by RNA interference (RNAi), were studied to elucidate the possible functions of RACK1 in responses to drought stress in rice. Real-time PCR analysis showed that the expression of RACK1 in transgenic rice plants was inhibited by more than 50%. The tolerance to drought stress of the transgenic rice plants was higher as compared with the non-transgenic rice plants. The peroxidation of membrane and the production of malondialdehyde were significantly lower, and the superoxide dismutase activity in transgenic rice plants was significantly higher than those in non-trangenic rice plants. It is suggested that RACK1 negatively regulated the redox system-related tolerance to drought stress of rice plants. 相似文献
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几种制剂对番木瓜环斑病的防治效果 总被引：1，自引：0，他引：1
分析研究水杨酸(SA)、病毒必克、草酸钾、磷酸钠和磷酸二氢钠等5种制剂对番木瓜环斑病发病前和发病后的防治效果,结果表明:发病前,0.05 g/L的水杨酸、O.1 g/L的病毒必克、1.0 g/L的草酸钾、0.5 g/L的磷酸钠、3.0 g/L的磷酸二氢钠的防治效果分别为71.67%,92.63%,83.72%,80.09%,76.2l%;发病后,水杨酸降低病级数1.67,病毒必克等也一定程度控制了病情发展,而清水处理的病级数上升了1.47.差异均极显著. 相似文献
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RNA干涉下调RACK1基因表达增强水稻抗旱能力 总被引：1，自引：0，他引：1
RACK1是一种多功能支架蛋白,广泛参与植物生长发育过程的调节。利用RNA干涉技术抑制水稻RACK1基因的表达,分析了RACK1基因在响应干旱胁迫中的功能。实时定量PCR对获得的转基因植株的RACK1基因表达分析结果表明,转基因水稻RACK1基因表达受抑制程度达50%左右。与非转基因水稻（对照）相比,转基因水稻耐干旱能力显著强于对照,其膜的过氧化酶和丙二醛的产生显著低于对照,而超氧化物歧化酶活性极显著高于对照。表明RACK1蛋白质调节水稻对干旱胁迫的耐性,并且这种调节在很大程度上与植株体内的氧化还原系统有关。 相似文献