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1.
藏獒犬α-干扰素全基因的克隆与序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank发表的犬α-干扰素(IFN-α)基因核酸序列(AB102731),设计并合成1对引物,利用PCR技术从藏獒犬肝脏基因组DNA中扩增犬α-干扰素全基因,并进行克隆和测序.结果表明,获得了犬IFN-α全基因序列,其大小为564 bp,包含1个完整阅读框,编码187个氨基酸残基.序列比较分析发现,克隆的藏獒犬IFN-α基因序列与GenBank中5条犬IFN-α基因序列核苷酸同源性在96.8%～99.3%之间,氨基酸同源性在94.7%～98.9%之间,并无插入和缺失变异,但是存在氨基酸点变异.藏獒犬与人和其他8种动物的IFN-α基因序列分析和系统进化分析表明,IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高.犬IFN-α基因的成功克隆为进一步研究藏獒犬IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础. 相似文献
2.
京巴犬α-干扰素全基因的克隆与分子进化分析 总被引：1，自引：0，他引：1
根据基因库(CenBank)中收录的犬α-干扰素(IFN-α)基因核苷酸序列(AB102731),设计并合成了1对引物,PCR扩增京巴犬IFN-α全基因,并克隆、测序.结果表明,犬IFN-α基因全基因序列为564 bp,包含1个开放阅读框,编码187个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有3个潜在的N-糖基化位点,有10个与二硫键形成有关的半胱氨酸.序列比较分析发现,京巴犬IFN-α基因序列与GenBank发表的其它品种犬IFN-α基因序列核苷酸同源性为96.3%以上,氨基酸同源性为94.1%以上,其中与AB102731核苷酸同源性最高,为99.5%.仅有3个碱基差异.京巴犬与人和其他8种动物的IFN-α基因序列分析和系统进化分析表明,IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高.京巴犬IFN-α基因的成功克隆为进一步研究犬IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础. 相似文献
3.
根据GenBank发表的鸭α-干扰素(interferon-alpha,IFN-α)基因序列(AY879230),设计并合成了1对引物,提取固始鸭和樱桃谷鸭基因组DNA,应用PCR技术扩增地方品种固始鸭和樱桃谷鸭IFN-α基因,并克隆、测序.测序结果表明获得了固始鸭和樱桃谷鸭IFN-α基因,大小均为584 bp,包含1个IFN-α基因完整的开放阅读框,编码191个氨基酸的多肽.推导的氨基酸有2个潜在的 N-糖基化位点,有7个与二硫键形成有关的半胱氨酸.克隆的固始鸭和樱桃谷鸭IFN-α基因与北京鸭IFN-α基因的氨基酸序列比较,仅固始鸭IFN-α基因发生突变D38N.固始鸭和樱桃谷鸭IFN-α基因与其他IFN-α基因的氨基酸序列遗传进化树分析表明樱桃谷鸭与北京鸭有很近的亲缘关系,固始鸭次之.地方品种固始鸭在非常保守的38位发生了氨基酸突变,推测这可能与该品种鸭具有很强的抗病能力有关. 相似文献
4.
根据GenBank中鸡α干扰素(IFN-α)基因序列设计1对引物,应用PCR技术直接从鸡肝组织基因组中扩增罗曼鸡、海兰鸡及固始鸡α干扰素基因,并进行克隆和测序.结果表明,获得了3个品种鸡IFN-α全基因序列,长度均为582bp,编码193个氨基酸残基.3个品种鸡IFN-α基因及推导的氨基酸序列比较结果显示,海兰鸡和罗曼鸡IFN-α基因序列完全一致,而固始鸡与海兰鸡和罗曼鸡IFN-α基因核苷酸同源性99.3%,有4个碱基发生非同义变异,氨基酸同源性为97.9%.克隆的3个品种鸡IFN-α基因序列与GenBank上发表的7条鸡IFN-α基因序列进行比较分析发现,核苷酸同源性在98.1%～100%之间,氨基酸同源性在96.9%～100%之间. 相似文献
5.
根据猫α-干扰素基因核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增狸猫α-干扰素全基因,并克隆、测序。用DNAStar软件及在线分析方法对克隆的IFN-α基因核苷酸及其推导氨基酸序列进行分析,并与人和其他种动物的IFN-α基因进行同源性和进化分析。结果表明,获得了狸猫α-干扰素全基因序列,其大小为631 bp,编码194个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有1个潜在的N-糖基化位点和7个潜在的O-糖基化位点。IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高。狸猫IFN-α基因的成功克隆为进一步研究猫IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础。 相似文献
6.
【目的】构建原核表达载体p ET28a-r Ch IFN-α-Ch IL-18、大肠埃希菌Escherichia coli表达及产物纯化与活性检测,研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂,以对鸡的病毒性疾病进行防治.【方法】采用融合PCR(Fusion PCR)方法,利用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR产物,通过PCR产物重叠链的延伸将鸡α干扰素(Chicken interferon alpha,Ch IFN-α)与鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18,Ch IL-18)基因构建Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因并克隆入p ET-28a原核表达载体中进行原核表达.通过镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白,并进行SDSPAGE分析、Western-blot鉴定.采用细胞病变抑制法检测r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白在细胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)及新城疫病毒(NDV)增殖活性.【结果和结论】成功构建并克隆了p ET28a-r Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因.融合基因在大肠埃希菌中表达的r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白相对分子质量约为38 000,蛋白经纯化后纯度在90%以上.r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白在鸡胚成纤维(CEF)细胞上具有明显抗病毒活性,其抗VSV和NDV的活性明显高于单一r Ch IFN-α、r Ch IL-18蛋白的抗病毒活性. 相似文献
7.
猪的病毒性疾病种类多且危害大,因此研发具有广谱抗病毒作用的猪α干扰素制剂具有重大意义.为了研制重组猪干扰素类制剂防制猪病毒性传染病,构建了携带猪IFN-α基因的重组腺病毒.应用PCR方法从猪肝组织基因组中扩增得到猪IFN-α基因后,直接克隆入腺病毒载体穿梭质粒中,构建出腺病毒重组穿梭质粒pAd-CMV-IFN-α,经Pme Ⅰ线性化后转化BJ5183感受态细胞,获得同源重组腺病毒质粒,Pac Ⅰ酶切后回收,脂质体介导下转染AD-293细胞,PCR检测表明成功构建了携带猪IFN-α基因的复制缺陷性重组腺病毒. 相似文献
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9.
[目的]克隆和分析沈阳地区黄牛中1个新的IFN-τ基因。[方法]根据NCBI上发表的的牛IFN-τ基因序列(AY665673),设计并合成1对特异性引物。从黄牛的肾脏组织中提取基因组DNA作为模板,进行PCR扩增。将扩增产物回收后,与pUCm-T载体连接并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。通过PCR和双酶切对获得的质粒进行鉴定后,进行测序和序列分析。[结果]经PCR扩增,获得1条约600 bp的特异性条带。牛IFN-τ基因成功重组到载体中,获得阳性克隆。序列分析结果表明,该克隆片段大小为586 bp,其在376 bp处出现了终止密码子,导致翻译终止。该片段与AY665673基因序列的核苷酸同源性为93.3%,氨基酸同源性为88.1%。[结论]该克隆片段可能为1个新的牛IFN-τ基因。 相似文献
10.
参照基因库中收录的犬α-干扰素基因序列设计1对引物,应用PCR技术直接从贵宾犬肝组织基因组DNA中扩增IFN-α基因,将回收得到的特异性片段克隆于pGEM-T Easy载体中,转化感受态细胞DH5α,经蓝白斑筛选,质粒PCR鉴定及酶切鉴定筛选阳性重组质粒,测定其核苷酸序列。测序结果表明,贵宾犬α-干扰素基因全长为564 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码187个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有3个潜在的N-糖基化位点,有10个与二硫键形成有关的半胱氨酸。用DNAStar软件将所得序列与人和其他种动物的IFN-α基因进行核苷酸及氨基酸同源性比较,并通过绘制系统进化树可知,IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高。 相似文献
11.
根据GenBank中鸡α干扰素（IFN-α）基因序列设计1对引物,应用PCR技术直接从鸡肝组织基因组中扩增罗曼鸡、海兰鸡及固始鸡α干扰素基因,并进行克隆和测序。结果表明,获得了3个品种鸡IFN-α全基因序列,长度均为582bp,编码193个氨基酸残基。3个品种鸡IFN-α基因及推导的氨基酸序列比较结果显示,海兰鸡和罗曼鸡IFN-α基因序列完全一致,而固始鸡与海兰鸡和罗曼鸡IFN-α基因核苷酸同源性99.3%,有4个碱基发生非同义变异,氨基酸同源性为97.9％。克隆的3个品种鸡IFN-α基因序列与GenBank上发表的7条鸡IFN-α基因序列进行比较分析发现,核苷酸同源性在98.1%～100%之间,氨基酸同源性在96.9%～100%之间。 相似文献
12.
[目的]为猫干扰素类生物制品的研究奠定基础。[方法]根据NCBI上的猫IFN-β基因序列,设计1对特异引物。以从病死猫肝脏组织中提取的基因组DNA为模板,进行PCR扩增。将扩增产物回收后,与pUCm-T载体连接,并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。通过PCR和双酶切对获得的质粒DNA进行鉴定后,进行序列分析和核苷酸、氨基酸序列同源性的比较。[结果]经PCR扩增,可获得一条561 bp的特异性条带。猫IFN-β基因已成功重组到载体中,获得阳性克隆。序列分析结果表明,亚洲猫IFN-β基因长561 bp,编码186个氨基酸,与已报道的猫IFN-β基因同源性达99.82%,而氨基酸序列未改变。[结论]该研究成功克隆了猫IFN-β基因,为进一步利用基因工程技术生产重组猫IFN-β基因及其生物学功能的研究奠定了基础。 相似文献
13.
真核生物延伸因子基因(EF-1α)在蛋白质翻译过程中起着重要的作用,其序列具有高度的保守性,常作为内参基因应用于real time PCR中。通过RT-PCR克隆出建鲤(Cyprinus carpio var.jian)EF-1α的部分cDNA序列,其长度为425 bp,翻译成140个氨基酸,Blast结果显示与其它鱼类leptin的相似性为98%。同时也克隆出建鲤EF-1α相应的DNA序列,共506 bp。cDNA和DNA的序列比对显示克隆出的建鲤EF-1α含有1个相位为0的内含子,在此基础上设计一对跨越内含子的引物,采用SYBR GreenⅠ染料建立了real time PCR方法。以肝脏cDNA为标准品,建立了标准曲线,并进行了融解曲线分析。结果表明,所建立的方法具有特异性强、相关系数高、线性范围广等优点,可应用于建鲤的功能基因表达研究。 相似文献
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小麦A GPase4个亚基的克隆及其组织特异性表达 总被引：3，自引：1，他引：2
采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号发育籽粒中克隆出小麦淀粉合成关键酶-AGPase的胞质型小亚基(cytosolic small subunit,SSU Ⅰ)、质体型小亚基(plastidial small subunit,SSU Ⅱ)、胞质型大亚基(cy-tosolic large subunit,LSU Ⅰ)和质体型大亚基(plastidial large subunit,LSU Ⅱ)的cDNA序列.所克隆的基因cDNA序列长度分别为1 465、1 631、1 941和535 bp.序列比对结果显示SSU Ⅰ、LSU Ⅰ和LSU Ⅱ与已往报道的大麦、小麦、玉米、水稻等相关基因的同源性较高,而SSU Ⅱ的cDNA序列为首次克隆,与大麦SSU Ⅱ相比,5'端缺失编码转移肽的一段序列,表明其可能对质体AGPase活性产生一定影响.通过半定量PCR法发现SSU Ⅰ与LSU Ⅰ在籽粒中表达量较高,而SSU Ⅱ和LSU Ⅱ在叶片中丰富表达. 相似文献
15.
根据甜味蛋白Brazzein基因成熟区的氨基酸序列,结合毕赤酵母的密码子偏爱性以及Brazzein蛋白质结构的相关研究,对甜味蛋白Brazzein基因进行改造,使表达的目的蛋白中包含3个突变氨基酸(29Asp→Lys,31His→Ala,41Glu→Lys)。采用重叠PCR(SOE-PCR)合成目的基因并克隆到pMD18-T载体,经测序鉴定,序列正确的质粒用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切。将回收得到的目的基因连接到经同样双酶切处理的pGAPZαA载体上,经PCR、酶切和测序鉴定,证明已成功构建pGAPZαA-Bra真核表达载体。将构建好的重组载体pGAPZαA-Bra用AvrⅡ线性化,电转进入巴斯德毕赤酵母中。筛选ZeocinTM阳性克隆菌,进行蛋白表达,SDS-PAGE结果表明蛋白表达成功。 相似文献
16.
首次建立以GAPDH为内参,同时检测鸭RIG-I、MDA5、IFN-α和IFN-γ等4种mRNA相对表达量的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法(RT-FQ-PCR)。以目的基因的克隆质粒为标准品,建立标准曲线,并进行熔解曲线、重复性及稳定性分析。该方法 Ct值线性范围为12.0~32.0;目的基因(RIG-I、MDA5、IFN-α、IFN-γ)和内参基因(GAPDH)的扩增效率均在95%~105%,其相关系数均在0.99以上;扩增产物的熔解曲线都只出现1个特异性单峰,无引物二聚体或其他非特异性产物生成,RIG-I、MDA5、IFN-α、IFN-γ和GAPDH的Tm值依次为(81.9±0.33)、(81.9±0.32)、(93.6±0.23)、(81.8±0.28)、(87.8±0.24)℃,其敏感度均达到100copies·μL-1,重复性和稳定性好,为从mRNA水平上深入研究RIG-I样受体、干扰素与鸭机体免疫功能相关性奠定了基础。 相似文献
17.
TANG Yong-kai YU Ju-hua XU Pao LI Jian-lin LI Hong-xia DONG Zai-jie XIA Zheng-long 《江西农业大学学报》2012,34(3)
真核生物延伸因子基因(EF-1α)在蛋白质翻译过程中起着重要的作用,其序列具有高度的保守性,常作为内参基因应用于real time PCR中.通过RT-PCR克隆出建鲤(Cyprinus carpio var.jian)EF-1α的部分cDNA序列,其长度为425 bp,翻译成140个氨基酸,Blast结果显示与其它鱼类leptin的相似性为98％.同时也克隆出建鲤EF-1α相应的DNA序列,共506 bp.cDNA和DNA的序列比对显示克隆出的建鲤EF-1α含有1个相位为0的内含子,在此基础上设计一对跨越内含子的引物,采用SYBR Green I染料建立了real time PCR方法.以肝脏cDNA为标准品,建立了标准曲线,并进行了融解曲线分析.结果表明,所建立的方法具有特异性强、相关系数高、线性范围广等优点,可应用于建鲤的功能基因表达研究. 相似文献
18.
为了建立高品质的犬肾(MDCK)单克隆细胞系,使用CRISPR/Cas9技术实现MDCK细胞IFN-β1基因的敲除,构建细胞培养禽流感病毒(AIV)增殖体系。首先,根据CRISPR/Cas9系统的技术要求构建了Cas9表达载体和sgRNA载体;然后,用3种载体共转染MDCK细胞,通过GFP阳性特征分选单细胞克隆,单细胞克隆培养在96孔板中。通过PCR扩增和对IFN-β1靶序列进行测序,确定了阳性MDCK单细胞克隆中IFN-β1的敲除。结果成功构建了具有IFN-β1敲除的MDCK单细胞克隆细胞系,与原始细胞相比,该细胞系的病毒增殖能力提高。 相似文献
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【目的】克隆鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因cDNA序列,构建并鉴定其原核表达质粒pET/DuMHC-Ⅰ。【方法】依据GenBank/DDBJ/EMBL基因库中公布的鸭MHC-Ⅰ基因序列设计1对引物,采用RT-PCR技术从鸳鸯鸭脾脏组织中扩增MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因cDNA,T-A克隆到pGEM-T Easy载体中,并进行测序。通过PCR和酶切的方法,将鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因亚克隆入pET-28a(+)载体,构建重组表达质粒pET/Du MHC-Ⅰ,并进行PCR、NcoⅠ和NotⅠ双酶切及测序鉴定。【结果】测序结果表明,获得了MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因,其长度为813 bp,编码271个氨基酸。MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因与GenBank中登录的鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因序列的同源性为89.4%~91.7%,氨基酸同源性为78.2%~83.7%;与鸡、鹅、鹌鹑、草鱼、狗、猪、鼠和人的MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽氨基酸序列的同源性分别为64.6%,79.3%,59.4%,41.0%,26.6%,45.0%,12.5%和22.1%,这表明MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因存在着种属多样性,且亲缘关系越近,同源性越高。所获重组表达质粒pET/Du MHC-Ⅰ经PCR、酶切、测序鉴定,证实鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因cDNA已正确克隆入pET-28a(+)表达载体。【结论】成功克隆出鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因,并构建了重组表达质粒pET/Du MHC-Ⅰ。 相似文献
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为对犬干扰索-β(IFN-β)进行研究,用PCR技术从犬血细胞基因组DNA中扩增了牧羊犬IFN-β基因,并克隆到pGEM-T载体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,阳性克隆经PCR和酶切鉴定后进行测序.结果表明:牧羊犬IFN-β基因含561bp,编码186个氨基酸,前21个为信号肽.成熟蛋白理论分子量为20kD,等电点为5.737,有2个潜在磷酸化位点、5个N糖基化位点和4个半胱氨酸残基,大部分为亲水区.二、三级结构预测显示,蛋白主要由5段α螺旋组成.犬IFN-β基因与赤狐的完全相同,与貉、雪貂和猫的同源性很高(85％～98.4％),在进化树中处于同一分支,而与禽类和鱼类的同源性仅为2.9％～8.6％. 相似文献