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1.
本研究旨在阐明鸡氨肽酶N(chAPN)、唾液酸以及硫酸乙酰肝素在传染性支气管炎病毒(IBV)M41株感染宿主细胞中的作用以及3种受体特异抑制剂对IBV M41株在自然宿主CEK细胞内增殖能力的影响.作者选择苯丁抑制素(Bestatin)、神经氨酸酶(NA)和肝素酶Ⅲ分别作为APN、唾液酸以及硫酸乙酰肝素的抑制剂,在不同条件下,单独或共同预处理CEK细胞,而后接入IBV M41株病毒感染细胞,应用荧光定量PCR方法定量检测IBVM41株在CEK细胞中的增殖变化,应用鸡胚半数感染剂量法(EID50)测定病毒感染鸡胚能力的变化.结果表明,经Bestatin和NA处理的CEK细胞获得了抵抗IBV M41株感染的能力,与未经处理的(对照组)细胞相比,Bestatin和NA能显著降低IBV M41株在CEK细胞内的增殖及对鸡胚的感染能力(P＜0.01),且Bestatin处理后CEK细胞内的病毒增殖量显著低于NA处理后CEK细胞内的病毒增殖量,两者病毒液的EID50滴定值差异显著(P＜0.01);肝素酶Ⅲ的处理则对病毒增殖无显著影响;3种受体抑制剂共同处理CEK细胞后,病毒增殖量显著下降(P＜0.01),但仍有病毒增殖,病毒液的EID50滴定值为102.12±0.05·0.1 mL-1.结果提示,chAPN在IBV感染宿主细胞的过程中发挥特异性受体作用,而唾液酸在IBV感染宿主细胞中发挥辅助受体作用,硫酸乙酰肝素不是IBV在自然感染中的必需因素,同时提示,可能存在其他未知受体因子参与IBV感染宿主细胞的过程. 相似文献
2.
《中国预防兽医学报》2017,(2)
为研究Ⅰ型菌毛在F18ac大肠杆菌(F18ac E.coli)粘附过程中的作用,本研究利用λ-Red同源重组系统构建了F18ac E.coliⅠ型菌毛主亚基编码基因fim A缺失突变株(F18ac△fim A),以野生株为对照,通过体外易感细胞粘附试验和生物被膜(BF)形成定量试验,探索Ⅰ型菌毛在F18ac E.coli粘附宿主细胞过程中的作用。体外易感细胞粘附结果显示,经8%甘露糖封闭Ⅰ型菌毛受体或fim A基因缺失后,F18ac E.coli对易感仔猪上皮细胞IPEC-1的粘附能力均显著下降。BF结晶紫定量试验显示,F18ac△fim A菌株形成BF的能力显著下降,而F18ac△fim A/pfim A回补株的粘附能力以及生物被膜形成能力均得到了恢复。本研究表明Ⅰ型菌毛是F18ac E.coli重要的粘附素,介导了F18ac E.coli对仔猪易感细胞的粘附过程。本研究为进一步阐释F18ac E.coli致病机制中多毒力因子的作用提供了实验依据。 相似文献
3.
为研究携带IBV DNA疫苗重组减毒沙门氏菌免疫原性,本研究将携带有禽传染性支气管炎病毒(IBV)S1、M、N基因的pVAX1-S1、pVAX1-M和pVAX1-N重组质粒转入减毒沙门氏菌X4550株,构建IBV S1、M、N基因DNA质粒重组减毒沙门氏菌X4550疫苗株(X4550/pVAX1-S1,X4550/pVAX1-M,X4550/pVAX1-N),用间接免疫荧光法(IFA)检测重组质粒体外表达,SPF鸡经口服免疫,测定体内组织分布及稳定性、特异性IgG、IgA、CD4+和CD8+T细胞含量并进行攻毒实验。结果表明,重组质粒可在体外细胞中表达目的蛋白;重组减毒沙门氏菌X4550疫苗株可在肠、脾、肝、心、肾、肺6个组织中分布并稳定存在;特异性IgG,IgA、CD4+和CD8+T细胞显著升高(p0.01),用104EID50IBV M41株攻毒,保护率达到73%(11/15)。本研究为研制IBV基因减毒沙门氏菌疫苗提供了依据。 相似文献
4.
为了在体外研究紫花地丁黄酮类提取物抗鸡传染性支气管炎病毒（IBV—M41）的作用,以鸡胚肾细胞为宿主细胞,阿昔洛韦为阳性对照药物,通过观察细胞病变效应（CPE）与空斑减数试验测定紫花地丁黄酮类提取物抗IBV活性,计算其IC50与治疗指数,并从药物对病毒的直接灭活作用、对病毒吸附的影响及对病毒穿膜的影响3个方面初探紫花地丁黄酮类提取物抗IBV活性的机理。结果：紫花地丁黄酮类提取物能明显抑制IBV的致病变作用,其IC50为16．52mg／L,TI值为15．76。研究显示,紫花地丁黄酮类提取物在体外对IBV直接灭活的效果明显,在高浓度时对抑制IBV吸附与穿入细胞具有一定作用。结果表明：紫花地丁黄酮类提取物在体外有明显的抗IBV感染作用,且主要是通过直接灭活IBV而发挥作用。 相似文献
5.
《中国兽医学报》2020,(5)
检测广西巴马小型猪内源性反转录病毒(PERV)整合到HEK293细胞基因组(HEK293-PERV-BM)后,宿主细胞的细胞周期、细胞凋亡及cyclin D1、CDK4、c-Myc、p53、p16和k-Ras等相关基因表达的改变,推测相关作用机制。检测发现P10代巴马小型猪内源性反转录病毒感染HEK293细胞模型(HEK293-PERV-BM)的细胞周期主要被阻滞在S期和G2/M期,细胞凋亡受到抑制,P25代细胞周期主要被阻滞在S期,细胞凋亡明显受到诱导。通过实时荧光定量PCR和Western blot检测发现细胞周期相关基因的表达与细胞感染模型传代次数(P1～P35)有密切关系,其中cyclin D1、c-Myc和k-Ras基因表现为先降低后升高,而CDK4和p16基因则恰好相反,同时,p53基因表达的改变不明显,据此可以推测P10代细胞周期的改变可能由Rb调控通路诱导发生,P25代细胞周期的改变可能由Rb调控通路与p53调控通路协同诱导发生。上述结果提示PERV的感染可能存在潜在的危险。 相似文献
6.
《中国家禽》2020,(5)
为研究新城疫病毒(NDV)La Sota株和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41株在低免疫鸡胚中进行同胚接种培养的可行性,通过将不同稀释倍数的La Sota株和M41株接种同一低免疫鸡胚,分别测定收获尿囊液La Sota株和M41株含量,确定最佳的稀释倍数以及适宜的培养温度和培养时间。结果显示:La Sota株和M41株以10 000∶5 000的比例稀释,培养96 h病毒含量和收获量最佳,La Sota株含量可达到109.17EID50/0.1 m L,HA效价为1∶1 024,M41株含量可达到106.50EID50/0.1 m L。接种后孵育温度为36.5℃时,每胚收获量比37℃培养增加了1.0～1.2 m L。按照此工艺生产病毒制备疫苗免疫SPF鸡,NDV和IBV抗体均符合国家标准要求。试验探索并优化了La Sota株和M41株在低免疫鸡胚中同胚接种的培养条件,为大规模抗原生产提供数据支持。 相似文献
7.
为了成功分离培养家兔毛乳头细胞(DPCs),为体外开展家兔毛囊发育的相关机制研究提供良好模型,本研究采用中性蛋白酶与胶原酶两步消化法,分离并纯化长毛兔DPCs,观察体外生长的DPCs细胞形态并绘制生长曲线。结果表明,长毛兔DPCs在第47天进入对数生长期;体外培养的DPCsα-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和波形蛋白(VIM)表达均呈阳性,证实分离培养的细胞确为毛囊真皮源性的毛乳头细胞。ECCK-8比较第3代和第9代DPCs的增殖特性,显示在120h和144h生长高峰时,第9代的细胞密度显著低于第3代的细胞密度(P0.05);细胞周期结果显示,在72h、96h、122h和144h时,第3代DPCs的G0/G1期比例显著低于第9代(P0.05),而G2/M期的细胞比例显著高于第9代(P0.05),表明传至9代以后DPCs不再适合体外培养。本研究成功建立了长毛兔毛乳头细胞体外培养条件,为体外研究家兔毛囊发育机制奠定良好的理论基础。 相似文献
8.
新生猪骨骼肌卫星细胞的培养鉴定及生物学特性 总被引：3，自引：0，他引：3
采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法获取新生猪骨骼肌卫星细胞,并进行体外原代和传代培养.观察细胞各个阶段的形态,通过生长曲线等手段研究骨骼肌卫星细胞的增殖与分化能力,利用RT-PCR以及免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定.结果显示两步消化法适用于骨骼肌卫星细胞的获取.在生长培养基作用下,细胞增殖旺盛;在分化培养基下,细胞分化良好,可融合成肌管.本研究探讨了猪骨骼肌卫星细胞体外培养、鉴定的方法及其生物学特性,为建立猪骨骼肌卫星细胞系打下了一定的基础. 相似文献
9.
为了选择适合山羊痘病毒AV41株增殖的原代细胞,提高山羊痘病毒疫苗生产效率,分别采用常规方法制备绵羊睾丸细胞、绵羊肾细胞、犊牛睾丸细胞3种原代细胞,接种山羊痘病毒细胞弱毒AV41株进行传代培养,比较该病毒株在3种细胞上所引起的细胞病变时间、病变形态及其传代稳定性等增殖特性,并进行特异性、安全性、效力测定,试验结果显示,AV41株在3种原代细胞上均可增殖,其特异性、安全性均符合兽药典要求。疫苗株在以上3种细胞上的TCID50浓度分别达到10-6.125、10-5.5、10-5.875/mL,细胞病变形态、病变时间、最高传代次数等增殖特性存在一定差异。试验证明,原代绵羊肾细胞或原代犊牛睾丸细胞可以作为山羊痘病毒疫苗生产的候选细胞。 相似文献
10.
为了研究人乳铁蛋白对宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用及其对细胞凋亡、p53蛋白表达和Caspase-3活性的影响,试验采用MTT方法检测细胞的生长抑制率、DNA片段化试验检测细胞凋亡、流式细胞术测定细胞周期、Western-blot检测p53蛋白表达、Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3的活性.结果表明:人乳铁蛋白对宫颈癌Hela细胞的抑制呈现时间和剂量依赖性,有73%的Hela细胞停滞在G0～G1期;Western-blot检测结果显示人乳铁蛋白可以上调p53蛋白的表达; 人乳铁蛋白作用48 h后Caspase-3的活性是0小时时的5.5倍,二者差异极显著(P<0.01).结果说明人乳铁蛋白能显著抑制宫颈癌Hela细胞生长,其抗肿瘤机制与诱导细胞凋亡、调控细胞周期、上调p53表达、活化Caspase-3有关. 相似文献
11.
《中国预防兽医学报》2021,(8)
正传染性支气管炎病毒(IBV)属于γ冠状病毒,是人类分离到的第一种冠状病毒,主要损伤鸡的呼吸系统和泌尿生殖系统,严重影响我国及世界养禽业的健康发展。IBV主要编码4个结构蛋白:S、E、M和N。其中,S蛋白含有S1/S2和S2'两个裂解位点。近年研究表明,S2'位置的弗林蛋白酶裂解位点(FCS)对MHV和SARS-Co V侵入易感细胞的途径具有重要调控作用,对IBV Beaudette株的传代细胞适应性起决定作用,FCS的缺失会导致Beaudette株无法在细胞系中正常生长。而该FCS对目前IBV流行株的影响尚不明确。 相似文献
12.
《中国动物传染病学报》2015,(2)
应用筛选出的鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)结构蛋白S1基因的T细胞抗原表位盒、Australia T株和M41株S1基因的B细胞抗原表位,定向克隆入真核表达载体p VAX1,构建成5个真核表达质粒:p VAX-S1T+M、p VAXS1B-M41、p VAX-S1B-T、p VAX-S1T+S1B-M41、p VAX-S1T+S1B-T。将每组提取制备的质粒溶液通过腿部肌肉多点注射免疫7日龄SPF雏鸡,28日龄时加强免疫1次,同时设立PBS组作为对照免疫组。分别在首免前及免疫后7、14、21 d以及二免后10 d翅静脉采血并分离血清,用间接ELISA方法检测抗体效价。二免后10 d用IBV病毒液攻毒测定保护率。ELISA抗体效价结果显示:二免后10 d各免疫组抗体水平达到最高,p VAX-S1B-T、p VAX-S1T+S1B-M41和p VAX-S1T+S1B-T组与PBS组相比差异均具有显著统计学意义(P0.05),p VAX-S1、p VAX-S1T+M和p VAX-S1B-T组与PBS组相比差异具有极显著统计学意义(P0.01)。攻毒结果表明,p VAX-S1、p VAX-S1B-T组的保护效率均为75%,高于PBS组(12.5%),表明表位抗原成分能够有效发挥保护效力,与S1全基因疫苗组保护率相当。本研究结果为研制安全有效的新型IBV疫苗提供了新的途径。 相似文献
13.
14.
本研究旨在建立一种操作简单的仔猪小肠上皮细胞体外培养体系，为猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）的相关研究提供材料。研究以未吃初乳的新生仔猪作为肠道供体，采用肠腔面刮取肠黏膜和机械分离分散的方式进行原代细胞的体外分离。采用0.1%胰蛋白酶差速消化法进行仔猪小肠上皮细胞的纯化；比较新生弱仔猪和正常仔猪作为供体对原代小肠上皮细胞活性的影响；MTT法比较不同代次原代细胞的增殖活性；免疫荧光和实时荧光定量RT-PCR方法检测PEDV毒株CV777在原代小肠上皮细胞感染和增殖情况。结果显示，本研究建立的体外分离培养方法能获得增殖活性良好的原代小肠上皮细胞，具有明显的"S"型细胞增殖曲线。通过胰酶差速消化可得到纯度高、形态单一的小肠上皮细胞，同时细胞连续传代5次仍保持良好的增殖活性。弱仔猪和正常仔猪分离培养的小肠上皮细胞的增殖活性比较显示，两者并没有明显区别，这为降低原代细胞培养的成本提供新的思路。免疫荧光和实时荧光定量RT-PCR结果显示，PEDV可感染本方法分离培养的仔猪原代小肠上皮细胞，并在其中进行复制增殖。本研究建立了一种操作简单、实用性强、成本较低的仔猪原代小肠上皮细胞体外培养方法，该方法培养的原代细胞可作为PEDV分离培养和相关研究的基础材料。 相似文献
15.
为探究体外弓形虫(T.gondii)感染小鼠小胶质细胞(Microglia)后对其极化的影响,将PLK株弓形虫接种原代小胶质细胞,分别在弓形虫感染细胞后6 h、12 h、24 h、36 h以及48 h收集细胞及培养上清,利用荧光定量PCR、western blot分别检测小胶质细胞M1型以及M2型标记分子的表达水平。采用Griess法和精氨酸酶活性试验分别检测细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶-1(Arginase-1)的酶活性。结果显示,弓形虫感染细胞后M1型标记分子iNOS与IL-6的mRNA转录水平与蛋白水平均显著上调(p0.001),而M2型标记分子Arginase-1与IL-10无明显变化(p0.05)。此外,酶活性检测结果显示iNOS在弓形虫感染6 h～48 h与对照组相比其表达水平有显著差异(p0.001),而Arginase-1在该时间段表达差异并不显著。本研究结果表明,弓形虫感染小胶质细胞后能够明显诱导静息状态的小胶质细胞向M1型极化,从而改变小胶质细胞的表型和生物学功能,本研究为进一步阐明弓形虫与机体免疫系统相互作用提供了依据。 相似文献
16.
旨在深入研究非经典细胞焦亡的激活机制,本研究在体外构建非经典细胞焦亡模型,利用PCR方法扩增人源目的基因Caspase-4、hGSDMD-FL和hGSDMD-p30,使用无缝克隆的方法连接到相应的载体中,构建重组真核表达质粒pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-hGSDMD-FL和pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC,利用VigoFect试剂转染到HEK293T细胞后,采用Western blot方法验证各蛋白的表达情况;通过质粒共转染的方法构建非经典的细胞焦亡模型,分别检测细胞上清中LDH的释放、GSDMD有无被切割为有活性的N端p30片段和荧光观察PI染色情况来确定非经典细胞焦亡模型是否构建成功。结果显示：pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-hGSDMD-FL重组质粒均成功构建,各蛋白于HEK293T细胞内均成功表达,质粒共转染后LDH分泌显著升高,Caspase-4将GSDMD全长片段切割为有活性N端GSDMD-p30片段,荧光显微镜观察到明显的PI染色,表明非经典细胞焦亡模型体外构建成功。非经典细胞焦亡模型在体外的成功构建,为进一步研究其激活机制奠定了基础。 相似文献
17.
《中国预防兽医学报》2020,(8)
为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在猪肺脏组织中的感染特性,本研究建立了高度分化的猪呼吸系统体外培养模型-猪肺组织精细切片(PCLS)。该培养体系包含肺脏组织中多种相关细胞并能够体现出肺脏组织的生理结构和生物学功能。本研究针对制备的猪PCLS进行生物学活性的鉴定,利用评估支气管上皮细胞纤毛摆动百分比的方法检测支气管上皮细胞纤毛活性,结果显示猪PCLS制备良好,在制备10 d以后仍保持95%以上的纤毛活性;利用活/死细胞染色法测定制备的猪PCLS体外培养后活细胞的比例,结果显示制备的猪PCLS在体外培养7 d后支气管上皮细胞和肺泡细胞仍为活细胞;利用间接免疫荧光试验测定猪PCLS中上皮细胞、杯状细胞和肺泡巨噬细胞(PAM)的完整性与分布情况,结果显示制备的猪PCLS上皮细胞和杯状细胞保存完整且猪PCLS中包含丰富的PAM。利用6株不同PRRSV分离株(HuN4、XD-15、WK-34、WK-38、LCL-75和DL-1510)以2.5×10~5TCID_(50)/片的剂量感染猪PCLS,检测不同PRRSV分离株在猪PCLS中的感染特性,结果表明不同PRRSV分离株在该培养体系中表现出不同的增殖能力。本研究表明猪PCLS可用于PRRSV的体外感染试验。本研究为PRRSV的体外研究提供了新的模型与方法,同时也为其它猪呼吸道病原体提供了新的研究平台。 相似文献
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犬细小病毒YBYJ株体外诱导MDCK宿主细胞凋亡的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为研究犬细小病毒(CPV)在体外能否诱导MDCK宿主细胞凋亡,本研究应用前期分离到的CPV YBYJ强毒株接种MDCK细胞,通过倒置显微镜观察CPV导致MDCK宿主细胞病变(CPE)情况,采用细胞凋亡DNA Ladder抽提试剂盒和Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒和Caspase-3活性检测试剂盒检测,观察CPV诱导MDCK宿主细胞凋亡情况。结果显示,CPV YBYJ强毒株可导致MDCK宿主细胞产生明显CPE,并出现明显的DNA Ladder,Annexin V-FITC/PI双染为阳性,Caspase-3活性显著升高,提示CPV在体外能够诱导MDCK宿主细胞凋亡。 相似文献
19.
《中国家禽》2020,(2)
为探讨银黄可溶性粉体外抗血清4型Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-4)的活性,应用MTT法与CPE法测定银黄可溶性粉对LMH细胞贴壁和单层生长的最大安全浓度,研究其对病毒增殖抑制、感染阻断和直接灭活的作用效果。结果显示,银黄可溶性粉对LMH细胞最大安全浓度为156.25μg/mL,在安全浓度范围内,加药组LMH细胞贴壁和细胞单层形成与细胞对照组无显著差异(P0.05)。156.25μg/mL银黄可溶性粉体外抗FAdV-4效果最好,病毒增殖抑制、病毒感染阻断和直接灭活试验的细胞存活率分别为96.1%、122.0%、99.7%,病毒抑制率分别为91.5%、143.8%、99.3%,均显著高于病毒对照组(P0.05)。此外,78.13μg/mL和156.25μg/mL的银黄可溶性粉体在病毒感染阻断试验中具有促进细胞生长作用。本研究为银黄可溶性粉用于因FAdV-4引起的鸡心包积液综合征的临床治疗提供理论依据。 相似文献
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为揭示鼠伤寒沙门菌SL-1344菌株RcsCDB系统STM1863调控子分子特征,及对STM生物学特性的影响。本研究通过PCR扩增STM1863基因并进行克隆和测序,预测分析其编码蛋白的分子特征;利用λ-Red同源重组技术构建STM-ΔSTM1863基因缺失突变株,并对其生化特性、遗传稳定性、酸碱胁迫环境中的适应性及粘附侵袭小鼠巨噬细胞的能力进行研究。结果显示：STM1863基因全长159 bp,编码52个氨基酸,具有一个跨膜和d1p32a同系物结构域;与SL-1344亲本株相比,STM-ΔSTM1863缺失株生化特性与亲本株无明显差异,生长速度与亲本株生长速度一致,但STM-ΔSTM1863在p H4.0酸应激下对数期生长速度显著低于亲本株（P<0.05）;粘附和侵袭小鼠巨噬细胞能力与亲本株相比极显著降低（P<0.01）。提示STM1863因参与了STM酸应激和粘附侵袭宿主细胞的调控,本研究为深入揭示STM1863对STM粘附侵袭宿主细胞的调控机制提供了参考。 相似文献