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转基因抗虫玉米的定量检测 总被引：1，自引：1，他引：0
建立高效、快速、准确的抗虫转基因玉米MIR162转化体特异性实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法。采用SYBR Green I和Taqman探针2种定量方法对抗虫转基因玉米MIR162进行了检测研究。SYBR Green I法MIR162转化体特异性片段和内标基因zSSIIb的熔解曲线均表现为单一峰,扩增特异性强;二者的扩增效率均在90%~100%之间,标准曲线相关系数R2均大于0.998。2种定量方法的检测限(LOD)均为24个拷贝,定量限(LOQ)为48个拷贝,灵敏度较高。重复测试结果表明,SYBR Green I法的标准偏差(SD)变化范围为0.05~0.13,相对标准偏差(RSD)范围为0.17%~0.40%,Taqman探针法的SD变化范围为0.03~0.14,RSD范围为0.11%~0.44%,说明2种定量检测方法具有良好的重复性和精密度。对MIR162含量为3%、1%和0.5%的混合样品的定量结果为：3.13%、1.09%、0.53%（SYBR Green I法）和3.07%、1.02%、0.50%（Taqman探针法）,RSD均小于10%,T检验分析表明2种定量方法定值结果差异不显著。本研究建立的2种实时荧光定量PCR均可有效对转基因玉米MIR162进行定量检测,可根据不同实际需求及实验室条件进行选择相应的检测方法。 相似文献
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以实时荧光定量PCR技术检测转基因玉米MON88017 总被引：2，自引：0，他引：2
根据转基因玉米MON88017的左侧侧翼序列和玉米内标基因(zSSIIb)分别设计特异性引物及Taqman探针,通过实时荧光PCR技术建立MON88017的定量特异性检测方法。利用含有内标基因和侧翼序列的标准质粒分子,建立了玉米内标基因和侧翼序列的标准曲线。检测了5个已知MON88017含量(0.01%、0.05%、0.10%、0.50%、1.00%)的混合样品中的转基因含量,结果表明检测底限可以达到19~30个阳性拷贝。该研究建立的实时荧光定量PCR技术灵敏度高、特异性强。 相似文献
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转基因玉米MIR162是美国先正达公司开发出来的新型抗鳞翅目昆虫的转基因玉米品种。本研究目的在于建立该品系转化事件特异性定性、定量检测方法并形成定性检测国家标准。定性PCR体系经实验室内部比对及实验室间循环验证结果表明,该体系特异性强,灵敏度较高(0.1%),具有良好的重复性、再现性。Taqman探针实时荧光PCR检测结果表明,所设计的探针特异性强,检测低限(LOD)在0.01%以下;定量标准曲线R2均为0.999,扩增效率为98.622%和99.602%,SD范围为0.014~0.209,RSD的范围为0.049%~0.879%,稳定性好;对转基因含量为1.0%、0.5%、0.1%的样品定量结果相对偏差在8%以内,结果较为准确。本研究建立的方法完全可用于含转基因玉米MIR162成分样品的检测。 相似文献
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转基因玉米MIR162转化事件特异性检测方法及其标准化 总被引：1，自引：0，他引：1
转基因玉米MIR162是美国先正达公司开发出来的新型抗鳞翅目昆虫的转基因玉米品种。本研究目的在于建立该品系转化事件特异性定性、定量检测方法并形成定性检测国家标准。定性PCR体系经实验室内部比对及实验室间循环验证结果表明,该体系特异性强,灵敏度较高(0.1%),具有良好的重复性、再现性。Taqman探针实时荧光PCR检测结果表明,所设计的探针特异性强,检测低限(LOD)在0.01%以下;定量标准曲线R2均为0.999,扩增效率为98.622%和99.602%,SD范围为0.014~0.209,RSD的范围为0.049%~0.879%,稳定性好;对转基因含量为1.0%、0.5%、0.1%的样品定量结果相对偏差在8%以内,结果较为准确。本研究建立的方法完全可用于含转基因玉米MIR162成分样品的检测。 相似文献
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以Bt176转基因玉米为材料,通过使用特异性引物和染料,对转基因玉米中外源基因cry1Ab进行了定量检测。研究发现,在优化检测体系的基础上,SYBR荧光染料法定量检测转基因玉米,具有更高的检测灵敏度和精确度,其检测阈值可降到0.05%,变异系数为0.09%~0.53%。 相似文献
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建立高效的目的基因检测方法是保障生物育种研发和产业化进程的重要技术支撑。应用常规PCR法、TaqMan探针实时荧光PCR法及叶片直接PCR法对转基因玉米叶片进行CaMV35S启动子和NOS终止子2个转基因元件的检测。结果表明,叶片直接PCR法分别较常规PCR方法和TaqMan探针实时荧光PCR法节约62%、48%的时间和25%、43%的成本,而且扩增出的目的条带清晰可见,符合目的片段大小,结果真实可靠,适用于大量转基因玉米植株叶片的快速筛选和鉴定。 相似文献
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本研究创建一种简单快捷、成本低廉、灵敏准确及可靠性强的高通量鉴定转基因玉米MON89034转化体的快速检测方法。采用多重实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)对转基因玉米MON89034品系进行检测,并针对转基因玉米MON89034靶标基因设计高效稳定的引物和探针,使用zSSIIb基因作为内源基因,避免检测出现假阴性,将反应体系及条件优化后,用实时荧光定量PCR仪进行扩增,初步建立转基因玉米MON89034双重实时荧光PCR检测方法,通过对该方法进行特异性和大样本可靠性测试验证,继而创建出一种高通量鉴定转基因玉米MON89034转化体的检测方法。通过建立的双重荧光定量PCR方法对转基因玉米、非转基因玉米和转基因大豆的DNA混合模板检测得出的结果表明,多种作物DNA混合模板可在单根PCR反应管内实现对zSSIIb基因和MON89034的同时检测,并在2 h内完成检测得到准确结果。目前,建立的该双重实时荧光PCR方法可用于多个转基因作物样品间快速筛查,检测快速,结果准确,可满足大多数检测机构日常检测的需求。 相似文献
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根据犬瘟热病毒核蛋白基因的保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针建立荧光定量PCR。构建FQ-PCR绝对定量的标准品,并对反应体系进行优化, 建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验方法的灵敏度并与普通RT-PCR法进行比较;特异性检验后进行临床标本的检验。结果显示：实验成功构建了绝对定量的参照质粒,标准曲线相关系数为0.994。犬瘟热病毒FQ-PCR检测反应的灵敏度为10 TCID50;5种非犬瘟热病毒病原体检测均为阴性;说明本实验建立的FQ-PCR具有快速、灵敏和稳定的特点,适用于临床样品的检验。 相似文献
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为进一步提升转基因水稻的定量检测效率,推动转基因定量标识制度的实施,对转基因水稻品系‘Bt汕优63’成分进行微滴式数字PCR法定量检测研究。基于转基因水稻品系‘Bt汕优63’的外源插入片段和水稻蔗糖磷酸盐合成酶基因SPS,选择、设计和合成高效特异性的内外源基因引物探针,用于微滴式数字PCR法扩增‘Bt汕优63’的内源基因和品系特异序列。引物探针优化实验表明,SPS60-F/R/P和‘Bt汕优63’品系基因-F/R/P适用于dd PCR双通道法定量检测‘Bt汕优63’成分。准确度验证试验表明,测得值与标准值相近,偏差分别为0.03、0.15、0.15、0.03。测得值的SD介于0.08~0.48之间,RSD介于4.86%~15.10%之间,小于欧盟要求25%,准确度较好。本研究建立的转基因水稻品系‘Bt汕优63’微滴数字PCR定量检测方法简便高效、准确度高,可用于农产品和食品中转基因水稻‘Bt汕优63’成分的定量检测。 相似文献
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巢式PCR和SYBR Green Ⅰ实时PCR检测转基因大豆方法的研究 总被引：1，自引：1，他引：0
为了建立转基因大豆检测技术,采用巢式PCR和SYBR Green Ⅰ实时PCR技术,检测转基因大豆外源基因(CaMV35S、CP4EPSPS)。结果表明,利用巢式PCR可检测出1 ng/μL转基因含量1%的大豆中的CaMV35S基因,而第一轮PCR的检测限为100 ng/μL;利用SYBR Green Ⅰ染料能结合双链DNA的特点,应用实时PCR技术可检测到CaMV35S、CP4EPSPS基因扩增所产生的信号,通过扩增产物的熔解曲线能有效地区分特异性产物,CaMV35S基因的检测限为0.1 ng/μL。同时利用该方法对黄豆、炒黄豆、豆干等样品进行检测,样品中未检出CaMV35S基因成分。巢式PCR方法明显提高了PCR的检测限,SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR方法能有效、快速检测CaMV35S转基因成分。 相似文献
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猪流行性腹泻病毒Real-time PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：1，他引：1
为定量检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）载量,建立PEDV的Real—timePCR方法。用RT-PCR方法扩增PEDV的M基因片段,构建含有M基因片段的重组质粒,用该重组质粒进行SYBRGreen I Real—timePCR,来建立检测PEDV的荧光定量PCR方法。结果显示：在（5．56×10^2-5．56×10^7）拷贝／皿范围内,所建立方法具有优良的线性关系,其决定系数为0．9996,扩增效率为99．5％,扩增产物的熔解曲线只有一个特异性峰,无引物二聚体峰,熔解温度为（81．18±0．21）℃。该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒II型等猪源病毒均检测不到扩增产物,重复性试验的变异系数小于3％,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明：建立的Real-timePCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏性高,可用于PEDV的定量检测及其早期感染的快速诊断。 相似文献
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标准物质是转基因检测结果可靠性、可比性以及准确性的重要参比,不可缺少。本文研究了植物转基因成分检测中基体标准物质的长期保存对PCR检出及低含量标准物质量值稳定性的影响。应用普通定性PCR、实时荧光PCR和微滴式数字PCR3种方法,对不同含量转基因标准物质和转基因检测样品进行了复现性和量值稳定检测。结果表明,-70～-75℃保存条件下, 9年保存期的转基因含量为0.1%的单一作物转化体标准物质中依然能得到清晰的转化体目标片段扩增,且Ct值在36左右。数字PCR定值结果表明, 9年保存期的转基因基体标准物质的量值保持稳定。11年保存期的大豆、玉米、水稻的混合基体样品中各转基因元件均能稳定检出。研究结果表明转基因基体标准物质的长期低温保存不会影响其各转基因元件的检出和作为转基因核酸检测阳性对照的应用。 相似文献
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通过定性PCR扩增了转基因水稻M12转化体特异性片段和水稻内标基因(sps)片段, 将PCR产物酶切连接后构建到T载体, 得到适于转基因水稻M12品系特异性PCR检测的质粒分子pM12, 建立了事件特异性定性、定量PCR检测方法。定性PCR结果表明, 本方法可特异性检测出M12, 检测限可达100拷贝单倍体水稻基因组; 定量PCR结果表明, M12和sps定量PCR标准曲线R 2为0.998和0.997, 扩增效率为95.3%和108.4%, 重复性分析标准偏差范围为0.043~0.276, 定量极限和检测极限可达100和10拷贝。对转基因含量为1.0%的混合样品定量结果的相对偏差在8.0%以内。本研究建立的方法可用于转基因水稻M12及其加工产品成分的检测。 相似文献
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猪伪狂犬病毒Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法的建立及应用 总被引：3，自引：1，他引：2
本研究根据猪伪狂犬病病毒gE基因序列,设计一对特异引物和探针,通过优化反应条件,建立了可区分猪伪狂犬野毒株及基因缺失疫苗株的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。结果表明：TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法灵敏度可达2.23×101拷贝/μL,比常规PCR检测方法高100倍;同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒（PPV）、均为阴性,无交叉反应;对30份疑似病料的TaqMan荧光定量PCR和普通PCR检测阳性率分别为40%和33%,两者符合率90%。表明该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测大量样品,可适合于PRV的临床诊断和流行病学调查。 相似文献
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单增李斯特菌定量检测方法研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立快速、准确、定量检测单增李斯特菌的方法,根据GenBank中单增李斯特菌hlyA基因序列设计引物,建立单增李斯特菌real-time PCR检测方法。标准曲线方程为Y=-3.311X +41.162,相关系数R2=0.991,扩增效率E =96.528%。Real-time PCR 检测单增李斯特菌具有快速、灵敏、高效的优点,适宜于食品中单增李斯特菌污染的调查及监测。 相似文献
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羊环形泰勒虫单管套式PCR检测方法的建立及初步应用 总被引：1，自引：1，他引：0
为了建立羊环形泰勒虫单管套式PCR检测方法并初步应用于临床检测。根据GenBank上发表的环形泰勒虫Tams1基因序列,设计内、外2对特异性引物,进行单管套式PCR检测方法研究,并进行了特异性、敏感性试验及临床应用试验。结果表明：该检测方法能够扩增的基因片段大小为476 bp,与GenBank收录的相关序列同源性高达93%~98%,而与附红细胞体、新孢子虫、艾美耳球、弓形虫RH株相关病原基因组均无交叉反应,能够检测出DNA的最小量为12 fg。并对57份临床样品进行了检测,检测阳性率为40.4%,高于常规PCR和血涂片镜检测,表明该检测方法具有较高的敏感性,可用于羊环形泰勒虫感染的早期诊断,有较好的临床应用价值。 相似文献