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1.
产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患病原菌,在一定条件下可引起多种严重疾病。为了调查不同动物A型产气荚膜梭菌流行情况及α毒素基因同源性,本试验从不同地区共采集病料307份,其中鸡133份(包括肉鸡112份、蛋鸡21份)、鸭65份、犬31份、猪14份、兔子20份、小鼠9份、牛粪便18份、鸵鸟粪便17份。取肠道内容物和粪便进行产气荚膜梭菌分离鉴定和毒素基因分型,并检测cpe、β2毒素基因携带率;从不同地区、不同动物源A型产气荚膜梭菌分离株挑选18株进行α毒素基因扩增,将所得基因序列进行同源性比较。结果显示,307份样品中68份(22.1%)呈产气荚膜梭菌阳性,不同动物源产气荚膜梭菌阳性率介于5.9%～44.4%;68株产气荚膜梭菌分离株α毒素基因阳性率为100%,所有分离株毒素基因分型均为A型,未检测到cpe毒素基因,β2毒素基因总阳性率为63.2%;分离株与NCBI参考菌株α毒素基因相似性介于97.8%～100%。结果表明,不同动物α毒素具有很高的同源性,本调查为研发A型产气荚膜梭菌α毒素通用疫苗提供数据支持。 相似文献
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根据GenBank已公布的产气荚膜梭菌和腐败梭菌的α毒素基因序列,分别设计并合成针对2种α毒素基因的特异性引物,通过扩增条件的优化,建立快速鉴别产气荚膜梭菌和腐败梭菌的双重PCR方法。特异性试验显示,产气荚膜梭菌和腐败梭菌参考菌株均扩增出了相应的预期目的条带,而大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌和链球菌则均未能扩增出相应条带。灵敏度试验结果显示,产气荚膜梭菌和腐败梭菌基因组DNA最低检测量分别为17.95pg/μL和1.261pg/μL。应用该方法对样品进行检测,其中5份为产气荚膜梭菌阳性。成功建立了特异性强、敏感性高的双重PCR方法,可以有效进行产气荚膜梭菌和腐败梭菌的快速鉴别,对羊梭菌病病原快速鉴定及流行病学调查具有重要意义。 相似文献
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犬产气荚膜梭菌的分离和PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
从12头疑似产气荚膜梭菌感染的猝死警犬中分离获得了18株病原菌，经生化试验及毒素中和试验，确定为A型和C型产气荚膜梭菌。参考GenBank中登录的基因序列，设计合成了针对产气荚膜梭菌α、β、ε、ι、CPE和β2共6对分型毒素基因的引物，对以前昆明地区分离的1株产气荚膜梭菌进行了PCR扩增，结果扩增出了与预期大小相同的6个基因片段，分别为233、196、324、446、567和665 bp。建立的PCR方法能同时用于产气荚膜梭菌鉴定和毒素分型，较细菌毒素检测方法快速，与细菌分离鉴定的结果一致。 相似文献
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旨在建立一种高效、快速、准确的检测产气荚膜梭菌并分型的多重PCR方法。根据GenBank上公布的产气荚膜梭菌α、β、ε、ι毒素的基因序列,设计、合成4对针对4种毒素的特异性引物。并通过改变引物浓度、退火温度等反应条件,对多重PCR方法进行优化。结果显示,对产气荚膜梭菌α、β、ε、ι毒素基因均扩增出了预期大小的目的条带,而金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、停乳链球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌均未出现条带;当核酸质量浓度降至12.5μg/L时,仍可清晰地扩增出α、β、ε、ι毒素基因对应条带。在核酸质量浓度降至3.12μg/L时,仍可观察到α与ε毒素基因扩增出的条带。在核酸质量浓度降至0.78μg/L时,α毒素基因对应的条带仍可隐约可见。应用该方法对68份疑似产气荚膜梭菌导致猝死的牛鼻拭子样进行检测,其中有52份样品检测结果显示为C型产气荚膜梭菌,剩余16份样品均为非产气荚膜梭菌,阳性率为76%。结果表明,本研究建立的多重PCR方法特异性强、灵敏度高重复性好,可准确地鉴别区分5种类型的产气荚膜梭菌。在采样时仅需采取疑似病畜的鼻拭子,操作简便、快捷、安全。对临床检测病畜的产气荚膜梭菌病有较为重要的... 相似文献
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《中国兽医杂志》2016,(5)
通过对死于出血性肠炎的圈养鹿的病原菌进行分离鉴定,为研制产气荚膜梭菌β-毒素单价和多价疫苗奠定基础。采集山西省内不同地区鹿场因出血性肠炎而死亡鹿的病料32例,经病原微生物分离培养、生化试验和血清型鉴定,分离得到C型产气荚膜梭菌,并测定分离菌所产毒素对小鼠的最小致死量。PCR扩增C型产气荚膜梭菌β-毒素基因,构建重组质粒p MD18-T-J28-C,进行酶切鉴定和核苷酸序列分析。结果 32株分离菌中有6株是C型产气荚膜梭菌,占18.7%;其余均为A型,占81.3%。筛选出毒力最强的菌株J28-C,最小致死量(MLD)为5.0×105CFU/m L。PCR扩增和核苷酸序列分析表明,经PCR得到了特异性的β毒素基因片段。表明造成山西省鹿出血性肠炎的病原菌为A型和C型产气荚膜梭菌,以A型为主。 相似文献
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为获得腐败梭菌α毒素和D型产气荚膜梭菌ε毒素的共表达产物,并鉴定其致死活性和反应原性,评价其免疫保护效力,利用PCR扩增腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素基因Gcsa和Gcpe并克隆至pETDuet-1质粒,转化E.coli BL21(DE3),自诱导培养基诱导这2段基因共表达;用SDS-PAGE和Western-blot以及小鼠毒性试验、抗毒素血清中和试验对表达产物进行鉴定;将诱导后的大肠杆菌灭活,制成铝佐剂疫苗1 m L/只皮下注射免疫家兔2次,测定免疫血清中和抗体效价,用1 MLD的腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素分别攻击。结果显示,所构建的E.coli BL21(pETDuet-Gcsa-Gcpe)可以同时表达Gcsa和Gcpe,表达产物能够与腐败梭菌和D型产气荚膜抗毒素血清反应;且具有小鼠致死毒性,只有用2种抗毒素一同作用,才能将其毒性中和;制成灭活疫苗免疫家兔,免疫血清对腐败梭菌毒素的中和抗体效价为2 MLD/0.1 m L,对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价≥50 MLD/0.1 m L;用2种毒素攻击,免疫组家兔全部保护,对照组全部死亡,达到《中华人民共和国兽药典》(2015版)效力检验标准。结果表明,所构建的表达载体可以实现α毒素和ε毒素的活性共表达,本研究为腐败梭菌和产气荚膜梭菌的多联基因工程灭活疫苗的研究提供了实验基础。 相似文献
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提取了A型产气荚膜梭菌贵州分离株的染色体DNA，经聚合酶链反应(PCR)扩增并回收获得了1条242bp的特异性片段，将该基因片段克隆到质粒载体pUC19中，并转化至大肠埃希氏菌JM109中；经氨苄青霉素(Amp)抗药性和显色反应筛选及重组质粒酶切分析、PCR鉴定和Southern-blotting检测，表明该重组质粒是产气荚膜梭菌α-毒素基因的克隆。 相似文献
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为了了解1例经诊断为产气荚膜梭菌病而死亡的阿尔巴斯种绒山羊感染的产气荚膜梭菌的毒素型和16S rRNA基因的遗传进化特性,试验设计5对特异性毒素引物,采用PCR方法进行毒素型的鉴定,对16S rRNA基因扩增和测序,对测序结果进行遗传进化分析。结果表明：只有α毒素引物扩增出约475 bp长的目的条带,阿尔巴斯绒山羊梭菌性肠炎的致病菌毒素为α毒素,为A型产气荚膜梭菌,其16S rRNA基因序列与天津地区产气荚膜梭菌(登录号为KP944160.1)位于同一分支,亲缘关系最近,核苷酸相似性为98.53%。说明此次阿尔巴斯绒山羊感染的产气荚膜梭菌的毒素型是A型,且鉴定菌株与天津地区产气荚膜梭菌(登录号为KP944160.1)起源于共同的祖先。 相似文献
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《中国动物传染病学报》2019,(6)
为了弄清反刍动物源产气荚膜梭菌新疆流行株的生物学特性和分子特征,本研究从新疆不同地区规模化养殖场和屠宰场采集158份牛羊临床病料,进行产气荚膜梭菌的分离培养;通过形态学、生化特性、16S rRNA序列分析对产气荚膜梭菌分离株进行鉴定;利用多重PCR技术扩增产气荚膜梭菌α、β、ε、ι、β2基因,将测序结果与NCBI数据库比对进行新疆流行株的基因分型。结果从158份临床病料中共分离出产气荚膜梭菌67株,形态学、生化和16S rRNA序列分析鉴定结果均为产气荚膜梭菌。毒素基因检测表明,其中α基因检出率为100.00%(67/67),ε基因检出率为17.91%(12/67),β2基因检出率为37.31%(25/67),β、ι基因未检出。毒素基因分型可将产气荚膜梭菌新疆流行株分为A、D型,其中A型占82.09%(55/67),D型占17.91%(12/67),提示产气荚膜梭菌新疆流行株优势型别为A型。本研究为产气荚膜梭菌流行病学研究和防控提供科学依据。 相似文献
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【目的】2023年4月至2023年5月，西藏拉萨市多地出现牦牛严重腹泻、便血甚至死亡的现象。试验旨在确定牦牛腹泻的病原菌并研究其生物学特性，以期为该地区牦牛腹泻病的防治提供参考。【方法】采集新鲜牦牛腹泻粪便样品进行厌氧培养，通过培养特性及染色镜检进行初步鉴定；对可疑阳性菌株进行生化特性、多重PCR毒素基因分型及cpe、netB、cpb2毒素鉴定，并进行cpa、cpb2、16S rRNA基因的遗传进化分析、部分分离株生长曲线测定及动物致病性试验；采用K-B法测定分离株的体外药物敏感性，统计不同分离株的多重耐药结果。【结果】从样品中分离纯化得到8株分离菌，在厌氧培养基中生长旺盛，在TSC培养基、5%脱纤维绵羊血平板、卵黄琼脂培养基上均呈现与产气荚膜梭菌相似的典型菌落，革兰染色为紫色大杆菌，初步判定为产气荚膜梭菌，命名为XZ-1～XZ-8。分离株生化检测结果与产气荚膜梭菌相符；分离株均携带cpa和cpb2基因，为A型产气荚膜梭菌；16S rRNA基因分析结果显示，8株分离株与产气荚膜梭菌参考株的相似性为97.3%～100%,在系统进化树中处于同一分支，而与屎肠球菌、大肠杆菌参考株处于不同分支... 相似文献
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多重PCR方法快速检测粪样中产气荚膜梭菌 总被引：4，自引：0，他引：4
建立了多重聚合酶链反应 (multiplexPCR)检测产气荚膜梭菌的α_毒素和肠毒素 (enterotoxin)基因。该方法可以检测猪粪便样品或小肠内容物中肠毒性产气荚膜梭菌。首先猪粪便样品经前处理后 ,接种选择性培养基 ,再挑取单个菌落溶于超纯水中 ,煮沸提抽 ,制备样品DNA ,进行PCR检测。从实验中我们成功的扩增出 32 4bp的α毒素基因片段和 2 33bp的肠毒素基因片段。以人工污染样品 10倍系例稀释后进行检测 ,该方法的检测灵敏度达到 1.0× 10 4 CFU/g并对 5 8份猪粪便样品检测 ,获得 5 3株产气荚膜梭菌 ,分离率为 91%,其中 4株为带有肠毒素的产气荚膜杆菌 ,占整个分离菌株的 7.5 %。因此多重PCR方法在检测粪样中的产气荚膜梭菌是一种非常有用的方法并可以快速检出肠毒素 ,从而避免了使用动物作定型试验。 相似文献
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试验旨在对宁夏一绵羊场疑似大肠杆菌与A型产气荚膜梭菌混合感染的死亡病例进行确诊并提出相应的防治方案。采用产气荚膜梭菌显色培养基及伊红美蓝固体培养基进行病原分离培养,对分离菌株进行16S rRNA基因序列PCR检测,依据16S rRNA序列构建分离株分子进化树;之后对大肠杆菌分离株毒素因子进行PCR检测,对产气荚膜梭菌分离株进行毒素分型鉴定。结果显示,分离株PCR检测获得了16S rRNA特异性条带;分子进化树结果显示,大肠杆菌分离菌株NXDC001与大肠杆菌在同一分支,产气荚膜梭菌分离菌株NXSJ001与产气荚膜梭菌在同一分支。大肠杆菌分离株检测出毒素因子HPI (irp2)及LEE (eae);产气荚膜梭菌分离株携带毒素因子cpa,证明分离株为A型产气荚膜梭菌。研究表明,试验成功分离鉴定大肠杆菌及A型产气荚膜梭菌各一株,证明病死羊为大肠杆菌及A型产气荚膜梭菌混合感染。 相似文献
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《中国兽医杂志》2020,(3)
对青海省互助县送检的2份病死羊组织,经细菌学厌氧分离培养,参考已发表的产气荚膜梭菌16S rRNA基因和毒素基因(α、β、ε、ι)合成引物,采用PCR和多重PCR扩增目的基因条带,并对分离株细菌的16S rRNA基因序列进行了同源性及系统发育分析。结果显示:从其中1份病死羊组织中分离获得1株β溶血型革兰阳性杆菌,经PCR和多重PCR扩增可得16S rRNA基因和α、ε毒素基因的目的条带;分离株细菌的16S rRNA基因序列与GenBank上已登录(登录号:NR113204.1、NR121697.2)的产气荚膜梭菌的相应序列具有高度同源性(≥99.0%),同KU714939.1的遗传关系最为亲密,因此经分子生物学方法鉴定分离株细菌为D型产气荚膜梭菌。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2016,(10)
为建立检测产气荚膜梭菌α毒素的方法,本研究以抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体为特异性检测抗体,对人工腹腔注射α毒素的病死兔器官组织进行免疫组化染色,经反应条件优化,建立了产气荚膜梭菌α毒素的免疫组化检测方法。应用该方法对临床16例疑似产气荚膜梭菌病兔组织中的α毒素进行检测,同时进行病原菌分离鉴定。结果显示,该方法可以检测到人工感染兔心脏、肺脏、脾脏、肾脏、膀胱、肝脏、胃、小肠、盲肠和延脑中的α毒素分布,对照组则均为阴性,具有良好的特异性;临床应用检测结果表明:16例疑似病兔胃和肾脏中α毒素的检测均为阳性,检测阳性率高于细菌分离培养。本研究建立的该方法可以用于产气荚膜梭菌病的临床诊断,也为该毒素在动物机体内的分布规律及致病机理的研究提供了可靠的手段。 相似文献
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《动物医学进展》2020,(7)
调查陕西关中地区牛奶中产气荚膜梭菌的污染情况及其优势血清型和携带的毒素基因。通过对3个奶牛场采集的86份牛奶样品进行细菌分离纯化,应用多重PCR鉴定分离菌株的血清型,进行cpb2、cpe毒素基因检测,并对场3的乳样按照GB 4789.13-2012规定的方法进行产气荚膜梭菌带菌量的测定。结果显示,个体乳样产气荚膜梭菌的分离率为11.3%(7/62),且全部为A型菌,57.1%(4/7)的分离菌株携带atyp.cpb2基因,但所有分离菌株均未检测到cons.cpb2和cpe基因。而混合乳样(24份)中未分离出目的菌。场3的28份乳样中3份产气荚膜梭菌阳性乳的带菌量为1 CFU/mL～15.3 CFU/mL。初步了解了陕西关中地区生鲜牛奶中产气荚膜梭菌的污染情况、血清型及其携带的毒素基因,为关中地区牛奶中该菌污染的防控提供科学依据,为该菌引起食物中毒的流行病学研究提供参考资料。 相似文献
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《中国兽医学报》2018,(11)
2016年,山东某规模化羊场新生羔羊暴发腹泻,并伴急性毒血现象,出现部分死亡个例。对该羊场的病死羔羊进行剖检,分离4株特征病原菌(分别命名为Cp1、Cp2、Cp3、Cp4),对病菌的形态特点、生化特性以及毒素基因序列进行PCR检测,最终确定病原菌为产气荚膜梭菌。PCR检测结果显示该菌的毒素基因有α毒素、β毒素和ε毒素;毒素毒力试验表明,产气荚膜梭菌毒素对小鼠有强致病性,并证明产气荚膜梭菌通过释放毒素致病而本身并不具有致病性;药敏试验发现,分离菌对青霉素、四环素、庆大霉素、复方新诺明和强力霉素的耐药率极高,可达85%以上,而对头孢噻肟、氯霉素、氟苯尼考、链霉素和恩诺沙星等有较强的敏感性;结合传统免疫措施配合抗生素药物的治疗,可一定程度控制该病的流行。本试验结果为羊B型产气荚膜梭菌病的防治提供了试验依据。 相似文献
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为建立产气荚膜梭菌α毒素的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法,本研究以抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体(MAb)为捕获抗体,抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体为检测抗体,建立了检测α毒素的DAS-ELISA。通过优化反应条件,建立标准曲线;并对建立的DAS-ELISA方法进行性能评价及初步应用。采用该方法测定产气荚膜梭菌α毒素的最低检测限为0.353倍的小鼠LD_(50),可定量范围为0.353~90.368倍小鼠LD_(50)。结果表明该DAS-ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可以用于大批量样品检测。初步应用结果显示:患产气荚膜梭菌病的兔群肠内容物中产气荚膜梭菌的α毒素水平显著高于健康兔群(p0.05)。本研究检测α毒素的DAS-ELISA建立有助于畜禽产气荚膜梭菌病的诊断及研究。 相似文献
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产气荚膜梭菌cpe~+菌株的筛选与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
参考相关资料,针对产气荚膜梭菌肠毒素基因(cpe)设计合成1对特异性引物,对34株贵州分离株进行PCR扩增,并将扩增产物连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取质粒进行PCR和双酶切鉴定后测序和分析。结果在34株产气荚膜梭菌贵州分离株中有1株C型菌株扩增出与预期大小相一致的目的片段,经克隆测序后,该片段大小为233 bp,其与产气荚膜梭菌参考株肠毒素基因序列的核苷酸同源性为99.6%~100%,推导氨基酸同源性为98.7%~100%,表明所扩增产物为产气荚膜梭菌的肠毒素基因片段。本试验筛选鉴定出1株产气荚膜梭菌cpe+菌株,为今后进一步探讨产气荚膜梭菌性食物中毒机制奠定了基础。 相似文献
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《动物医学进展》2016,(12)
C型产气荚膜梭菌能够引起人类和一些动物的坏死性肠炎。该菌能产生α外毒素和β外毒素,大部分该菌菌株也能分泌出产气梭菌细胞溶素O(PFO)和TpeL。试验证明β外毒素是C型产气荚膜梭菌的主要致病毒素。在兔子肠襻和小鼠模型试验中发现,通过细胞中同源基因C型产气荚膜梭菌β毒素敲除基因突变株而导致该菌株失去毒力。当野生型β毒素基因补充这些突变体时毒素的活力将会复活。大多数C型产气荚膜梭菌产生的所有毒素(除TpeL外)都易与肠癌(Caco-2)细胞紧密结合并发生反应,比它在体外生长更加迅速。VirS/virR双组分调节系统(TCRS)被证明是在Coca-2细胞中导致β毒素和PFO产生快速上调。当virR基因被抑制时,pfoA和β毒素基因的表达也会受阻,这种系统是可逆的,virR表达时会恢复。通过β毒素作用于动物模型的试验研究,来寻找有效的预防措施。 相似文献