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非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种烈性传染病,对中国猪养殖产业的发展存在巨大的潜在威胁。为了建立有效的检测手段来防控ASFV的流行,本试验以GenBank中ASFV基因组序列为基础,运用在线软件对ASFV结构蛋白P72的优势线性抗原表位进行预测分析,利用预测结果分析合成多表位融合基因P72 (MeP72)。再将MeP72经pMD19-T克隆后插入到原核表达载体pET-32a(+)中得到重组质粒pET-MeP72,双酶切验证在402 bp及5 000 bp以上有条带,证明重组质粒构建成功。转化重组质粒pET-MeP72至大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21 (DE3),用IPTG诱导表达并优化诱导条件,分析重组蛋白反应原性。SDS-PAGE检测结果显示,MeP72重组蛋白的分子质量为30.74 kDa;Western blot分析显示MeP72重组蛋白可被ASFV阳性血清特异性识别,表明其反应原性良好;小鼠免疫试验证实MeP72蛋白可诱导机体产生特异性抗体,具有良好的免疫原性。研究表明MeP72重组蛋白可在大肠杆菌中高效表达,并诱导机体产生特异性抗体,为诊断抗原的研发奠定了前期基础。 相似文献
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为了建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)间接酶联免疫吸附试验(iELISA),利用杆状病毒表达载体pFastBac HTA在昆虫细胞Sf9中表达非洲猪瘟病毒的VP73蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测显示重组蛋白大小约65ku,能与ASFV标准阳性血清发生特异性结合。以此重组蛋白作为检测抗原包被酶标板,初步建立了检测ASFV血清抗体的iELISA方法。表达的重组蛋白具有良好的特异性,为制备ASFV免疫血清学诊断检测试剂和疫苗提供了材料。 相似文献
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非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种高致病性病毒性传染病.为制备兔抗ASFV A137R蛋白多克隆抗体,本研究以ASFV Pig/HLJ/2018分离株基因组DNA为模板扩增ASFV A137R基因,将其克隆至原核表达载体pET-21a(+)中,构建重组表达质粒pET-21a-A137R,转化大... 相似文献
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为研究真核表达非洲猪瘟病毒(ASFV)主要结构蛋白p72,本研究从含ASFV p72基因全序列的重组质粒pGEX-6p-p72中扩增出1 941 bp的p72全长基因,将其插入于pFastBac HTa杆状病毒载体中,构建了重组质粒pFastBac HTa-p72,转化至感受态细胞DH10Bac中,获得重组杆粒rBacmid-p72。再将其转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。Western blot和夹心法ELISA分析表明ASFV p72基因在昆虫细胞sf9中获得了正确表达,重组p72蛋白可以被特异性抗ASFV血清、p72单克隆抗体识别,表明该蛋白特异性强、活性稳定,具有良好的抗原性。为进一步研究p72蛋白的结构、功能和免疫学特性奠定基础。 相似文献
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为制备非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)CP312R蛋白的单克隆抗体,以真核表达ASFV的CP312R蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,并通过间接免疫荧光法(IFA)对获得的单克隆抗体进行反应性鉴定。结果利用杆状病毒表达系统(baculovirus expression system, BES)构建获得重组转移载体pOET3-CP312R,与杆状病毒基因组flashBACTM ULTRA共转染Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒AcMNPV-CP312R,且该病毒以胞内可溶形式表达出重组ASFV CP312R蛋白质。通过蛋白质印迹法鉴定显示重组CP312R蛋白可以与ASFV阳性血清发生特异性反应。此外,筛选获得2株针对重组CP312R蛋白的单克隆抗体(McAb),间接ELISA方法鉴定抗体滴度不低于1∶1 024 000。IFA试验检测表明,单克隆抗体与非洲猪瘟抗原发生特异性反应。本研究为非洲猪瘟亚单位疫苗研发及血清学检测方法的建立提供物质储备。 相似文献
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根据GenBank登录的非洲猪瘟病毒(ASFV) VP73基因序列,人工合成VP73主要抗原表位区基因片段,克隆至pUC57载体中.设计1对引物,PCR扩增获得429 bp的VP73基因片段;将VP73基因片段使用EcoRI和SalI酶切后亚克隆至表达载体pGEX-KG,经PCR、酶切、测序鉴定挑选阳性克隆,转化至表达菌株BL21 (DM3)中,进行体外诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析蛋白表达及其活性.结果显示,成功构建表达重组载体pGEX-KG-VP73,对该重组载体进行诱导,有效表达了41 ku重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白的17％,Western blot分析证实该蛋白具有良好反应原性. 相似文献
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本研究旨在构建能够表达非洲猪瘟病毒(ASFV)P72蛋白的缺陷型重组腺病毒。参考ASFV China-SY18株的基因序列,合成B646L基因。先将合成的B646L基因通过TOPO连接克隆到过渡载体pENTR/D-TOPO中;再将插入B646L基因的过渡载体pENTR/D-TOPO-ASFV-P72与pAd/CMV/V5-DEST腺病毒骨架载体进行重组,得到pAd-ASFV-P72重组质粒;重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,连续传代后获得重组腺病毒。结果表明,获得的Ad5-ASFV-P72重组腺病毒的滴度为2.53×10~9 IFU·mL~(-1);经免疫荧光方法及Western blot鉴定ASFV-P72蛋白在Vero细胞中成功表达,且能够与ASFV标准阳性血清发生特异性反应。本研究成功获得能够表达ASFV P72蛋白的重组腺病毒Ad5-ASFV-P72,不仅为ASFV多基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了一定基础,还为ASFV相关血清学诊断方法的建立提供了安全有效的抗原。 相似文献
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为了建立一种能够检测非洲猪瘟病毒(ASFV)特异性抗体的单抗阻断ELISA方法，本试验首先构建了非洲猪瘟病毒p30蛋白的原核表达载体，进而制备并筛选出1株能特异性识别p30蛋白的高亲和力单克隆抗体，采用昆虫杆状病毒表达系统Bac-to-Bac进行该单克隆抗体的表达。以p30重组蛋白作为包被抗原，辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体作为阻断抗体建立了一种非洲猪瘟病毒特异性抗体的检测方法，并验证其敏感性、特异性以及与商品化试剂盒的符合率。结果显示，该方法敏感性为100%,特异性为100%,与商品化试剂盒比较，符合率为98.7%。结果表明，本试验基于非洲猪瘟病毒特异性单克隆抗体建立的阻断ELISA方法敏感性好、特异性强，结果准确可靠，可用于非洲猪瘟病毒抗体检测。 相似文献
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为制备ASFV CP312R基因编码蛋白的多克隆抗体,利用PCR方法从非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的灭活样品中扩增出924 bp的CP312R基因全长序列,利用同源重组法构建出原核表达质粒pCold-Ⅰ-ASFV-CP312R,将其转化至原核表达感受态细胞BL21中,经1 mmol/L的IPTG低温条件下诱导表达CP312R编码蛋白并经过镍柱亲和层析纯化后,利用SDS-PAGE对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析,表达蛋白的相对分子质量约为34 kDa,通过Western blot分析,该蛋白能被ASFV抗体特异性识别。将所得的蛋白经处理纯化后免疫小鼠3次,得到含多克隆抗体的血清。利用该抗体检测实验室构建并拯救的表达ASFV CP312R基因编码蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV),结果显示该多抗具有良好的反应原性和特异性,并且证明了ASFV CP312R基因编码蛋白可在PRRSV活载体中稳定表达。 相似文献
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非洲猪瘟病毒pS273R蛋白水解酶单克隆抗体制备 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究旨在制备非洲猪瘟病毒（ASFV） S273R蛋白的特异性单克隆抗体。本研究以原核表达的非洲猪瘟病毒重组S273R蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示：基于纯化的S273R蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了4株可稳定分泌抗ASFV S273R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并通过免疫印迹（Western blot）和免疫荧光试验（immunofluorescence assay,IFA）测定了其免疫特性。4株单克隆抗体亚类均为IgG1型,轻链均为κ链。本研究获得的非洲猪瘟病毒S373R蛋白单克隆抗体可为进一步研究ASFV pS273R的生物学功能及基因缺失毒株的鉴别诊断和疫苗开发提供技术储备。 相似文献
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非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的制备及初步应用 总被引：1，自引：1，他引：0
为制备非洲猪瘟病毒（ASFV）p62蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于感染组织样品中ASFV抗原的免疫组化（IHC）检测,本研究以杆状病毒表达的非洲猪瘟病毒重组p62蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示：基于纯化的p62蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了18株可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA检测,制备的单克隆抗体均与非洲猪瘟病毒反应,且不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型等猪源常见病毒反应,特异性良好。抗体识别蛋白的鉴定结果显示,3株MAbs识别p35蛋白,15株MAbs识别p15蛋白。14株MAbs重链亚类为IgG1型,4株MAbs重链亚类为IgG2a,轻链均为κ链。利用18株MAbs对ASFV感染猪的肺、扁桃体、淋巴结等组织进行IHC检测,结果显示5株MAbs均能够与感染ASFV的组织发生特异性的免疫反应。本研究获得的非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体可为非洲猪瘟病毒免疫学检测方法的建立及p62蛋白的结构功能等基础研究提供重要的生物材料。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2015,(11)
为表达非洲猪瘟病毒(ASFV)P30蛋白,本研究采用PCR方法扩增ASFV p30基因,并克隆至p OET-1载体中构建重组质粒p OET-P30,将其与flash BAC DNA共转染Sf9昆虫细胞,制备了表达P30蛋白的重组杆状病毒,并通过SDS-PAGE和western blot对重组杆状病毒进行鉴定。结果显示,表达的重组蛋白约为30 ku,能够与His标签单克隆抗体和ASF阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组P30蛋白包被ELISA板对相关抗体进行检测,结果显示该重组蛋白仅与ASFV阳性血清发生反应,而与其他疫病阳性血清均无交叉反应,该抗原具有良好的反应原性。该蛋白的表达为ASF血清学检测方法的建立奠定了基础。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2020,(5)
为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p62蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于感染组织样品中ASFV抗原的免疫组化(IHC)检测,本研究以杆状病毒表达的非洲猪瘟病毒重组p62蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示:基于纯化的p62蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了18株可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA检测,制备的单克隆抗体均与非洲猪瘟病毒反应,且不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型等猪源常见病毒反应,特异性良好。抗体识别蛋白的鉴定结果显示,3株MAbs识别p35蛋白,15株MAbs识别p15蛋白。14株MAbs重链亚类为IgG1型,4株MAbs重链亚类为IgG2a,轻链均为κ链。利用18株MAbs对ASFV感染猪的肺、扁桃体、淋巴结等组织进行IHC检测,结果显示5株MAbs均能够与感染ASFV的组织发生特异性的免疫反应。本研究获得的非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体可为非洲猪瘟病毒免疫学检测方法的建立及p62蛋白的结构功能等基础研究提供重要的生物材料。 相似文献
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非洲猪瘟病毒（ASFV）EP364R蛋白是ASFV的ERCC4核酸酶结构域。为了获得具有免疫原性的EP364R蛋白,本研究将ASFV EP364R基因构建到杆状病毒表达载体上,将重组质粒转座DH10Bac感受态中,经过3次蓝白斑筛选,获得重组BacmidEP364R质粒,将Bacmid-EP364R质粒转染至细胞中,收获上清,在正常细胞中传三代,以获得重组杆状病毒rBac-EP364R。使用Western blot和间接免疫荧光（IFA）实验鉴定重组蛋白得到表达及其免疫原性。本研究结果显示,在感染的细胞可检测到EP364R蛋白的表达,并可被His单克隆抗体特异性识别。结果表明杆状病毒系统成功表达EP364R蛋白并具有良好的反应活性,为后续开展ASFV血清学诊断和亚单位疫苗的研究奠定基础。 相似文献
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为了研发非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的免疫学诊断试剂，试验将ASFV B646L基因克隆至pET-30a(+)载体中构建表达载体pET-30a(+)-p72,利用大肠杆菌表达系统表达重组蛋白，采用SDS-PAGE分析诱导表达的大肠杆菌，以镍柱对重组蛋白进行纯化，通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定纯化的重组蛋白。用纯化后的重组蛋白免疫Balb/c小鼠，通过细胞融合方法制备杂交瘤细胞。采用间接ELISA方法筛选并检测单克隆抗体，以Western-blot及IFA方法鉴定单克隆抗体的特异性，并通过Mouse Monoclonal Antibody Isotyping ELISA Kit鉴定单克隆抗体的亚型。结果表明：PCR扩增得到大小约为1 941 bp的B646L基因，并成功构建了表达载体pET-30a(+)-p72。诱导表达的大肠杆菌在72 ku处出现目的条带，纯化后的重组蛋白p72在72 ku处出现目的条带。筛选出4种单克隆抗体2C7D8、2E6D12、3B10E3、4G5E6,其效价在1∶100 000～1∶500... 相似文献
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本研究根据非洲猪瘟病毒（ASFV）Georgia 2007/1毒株的EP364R基因序列（Gen Bank登录号：FR682468.1）合成EP364R基因序列,通过PCR技术扩增目的基因EP364R,并克隆到p ET-32a（+）载体,成功构建了重组质粒p ET-32a-EP364R,鉴定正确后将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功诱导表达,纯化后的重组蛋白利用SDS-PAGE、Western blot进行鉴定。以纯化的p ET-32aEP364R重组蛋白为诊断抗原,成功建立了检测ASFV的间接ELISA抗体检测方法。将建立的间接ELISA检测方法与法国ID-Vet非洲猪瘟抗体试剂盒分别对临床84份血清进行检测,总符合率达89.3%,表明该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。为ASFV的快速诊断、流行病学调查和血清学抗体检测提供了快速实用的检测手段。 相似文献