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1.
为获得狂犬病病毒(rabies virus,RV)SRV9株的基因组全长cDNA克隆并对其进行基因修饰,深入研究狂犬病病毒的基因组特性及构建新型病毒载体,本研究根据GenBank中公布的SRV9基因组序列设计数对引物,以SRV9病毒为材料,从病毒总RNA中将全长基因组11 928 bp分5段扩增,克隆至载体测序鉴定。测序正确后,设计引物缺失基因组Ψ区并在缺失位置插入人细胞色素C基因,又设计引物删除糖蛋白(G)胞质区(CD区)。利用引物在病毒基因组起始处添加锤头状核酶序列,在病毒序列结尾处添加了丁型肝炎核酶序列。再次测序后克隆至pcDNA3.1(+)载体,利用扩增片段自身内切酶位点顺次进行修饰后全长连接,从而获得含修饰SRV9全长基因组的质粒pcDNA3.1-SRV9,为RV感染性克隆的建立奠定了基础。 相似文献
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[目的]重组狂犬病病毒SRV9株磷酸化蛋白的P基因和基质蛋白的M基因,为构建狂犬病毒(SRV9)全长cDNA提供技术支撑.[方法]设计重组PCR引物,分别扩增SRV9的P基因和M基因,构建重组质粒pMD18-PM,并对重组质粒进行酶切、测序鉴定.[结果]PCR扩增的SRV9的P基因和M基因大小分别为893 bp和608 bp,与GenBank已发表的狂犬病病毒SRV9(登录号:AF499686)序列比较,同源性分别为99.66;和99.67;.融合基因PM片段大小为l 501 bp,与预期大小相同,且融合完全.[结论]应用重组PCR成功融合狂犬病病毒SRV9磷酸化蛋白P基因和基质蛋白M基因,为后续构建病毒全长cDNA及感染性克隆奠定基础. 相似文献
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以伪狂犬病毒TK-/gI-缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA,克隆含gG基因的EcoRⅤ/StuⅠ片断,用限制性内切酶BamHⅠ和NdeⅠ缺失gG基因,构成重组质粒pIRⅤ。同时,分别将狂犬病病毒SRV9的株糖蛋白和绿色荧光蛋白克隆入载体pIRESneo,构建平行表达糖蛋白和绿色荧光蛋白表达盒。将表达盒插入到pIRⅤ,构建gG基因缺失转移载体,为下一步同源重组获得伪狂犬病毒奠定基础。 相似文献
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以伪狂犬病毒TK^-／gI^-缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA,克隆含gG基因的EcoR V／StuⅠ片断,用限制性内切酶BamHⅠ和NdeⅠ缺失gG基因,构成重组质粒pIRV。同时,分别将狂犬病病毒SRV9的株糖蛋白和绿色荧光蛋白克隆入载体pIRESneo,构建平行表达糖蛋白和绿色荧光蛋白表达盒。将表达盒插入到pIRV,构建gG基因缺失转移载体,为下一步同源重组获得伪狂犬病毒奠定基础。 相似文献
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伪狂犬病病毒gG基因缺失通用转移载体的构建 总被引：4，自引：0，他引：4
对克隆有伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA SphI 15kb片段的质粒pBSA用SphI和KpnI消化，将含gG全基因及其上游PK基因，下游gD基因部分编码区的约2．6kb的片段亚克隆到消除了EcoRI位点的载体pUC19中，获得重组质粒pUSK(E)。以pEGFP-N1为模板，通过PCR扩增约0．3kb的SV40Poly(A)片段，并将其克隆到杆状病毒转座载体pFastBac1的NotI和PstI位点，利用pFastBac1的BamHI和PstI将含有9个酶切位点以及SV40Poly(A)的片段亚克隆到pUSK(E)的相应位点，在插入的同时导致gG基因5‘端编码区约9个酶切位点以及SV40Poly(A)的片段亚克隆到pUSK(E)的相应位点，在插入的同时导致gG基因5‘端编码区的400bp的缺失，构建了由gG启动子驱动gG部分编码区缺失的通用转移载体pgG-Uni。序列分析进一步证实：有7个单一酶切位点可供外源基因直接插入。上述结果为构建以伪狂犬病病毒作载体的多价基因工程疫苗以及利用标记蛋白探讨伪狂犬病病毒在体内的增殖与分布奠定了基础。 相似文献
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[目的]构建犬细小病毒(CPV)VP2基因真核表达质粒,为研究核酸疫苗奠定基础.[方法]根据CPVVP2基因序列设计特殊引物,采用PCR方法从疑似"犬细小病毒"的患犬粪便基因组中扩增VP2基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证后,小白鼠尾静脉注射瞬时表达VP2基因,8 h后取小白鼠肝脏提取总RNA,进行RT-PCR扩增.[结果]在病犬粪便基因组中扩增得到1 755 bp的VP2基因片段,并构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-VP2,从瞬时表达的小白鼠肝脏总RNA中可扩增到目的条带.[结论]成功构建了犬细小病毒VP2基因真核表达重组质粒,并在小白鼠体内进行了瞬时表达. 相似文献
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根据狂犬病病毒核蛋白基因保守区序列设计1对引物，建立了用于狂犬病病毒特异性核酸检测的RT-PCR技术。该技术可从狂犬病病毒CVS株、8202株和SRV9株的含毒细胞培养物及鼠脑组织中．扩增出443bp的核酸片段，检出核酸的敏感性约为3pg。对30份不同种动物脑组织的检测结果与小鼠脑内接种试验(MIT)的测定结果完全吻合，但前者可在3h内直接对组织匀浆进行诊断，具有快速、简便和敏感的优点。 相似文献
9.
[目的]研究新疆棕色棉纤维色素决定基因的QTL定位,为分子标记辅助选择育种提供理论依据.[方法]通过中棉所41号和彩色棉1号杂交的F2群体作为QTL定位群体,在整个棉花基因组中选择350条引物,应用复合区间做图法,对棕色棉纤维色素决定基因进行QTL定位.[结果]经过亲本筛选后,共得到多态性引物45对.分别用此45对引物对F2代群体的137个单株进行扩增,检测到9个QTL连锁群,其中两个有效QTL位点定位到15号染色体上,分别命名为qFC15-1和qFC15-2,可解释表型变异率分别为16.3和0.5.[结论]筛选获得2个棕色棉纤维色素决定基因QTL位点,为进一步克隆该基因奠定基础. 相似文献
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表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
【目的】以伪狂犬病病毒为载体，构建表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组病毒，并研究其生物学特性。【方法】将猪2型圆环病毒ORF2基因插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体中，构建猪2型圆环病毒-伪狂犬病病毒重组中间转移质粒，然后将该质粒与伪狂犬病病毒TK-/gG-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞，待发生细胞病变后收集病毒液进行重组病毒的筛选及生物学特性测定。【结果】利用检测PCV2 ORF2基因和LacZ基因的PCR方法筛选到重组病毒TK-/gG-/ORF2+，同时用Southern blotting证实外源基因PCV2 ORF2已成功插入到TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组中。间接免疫荧光试验（IFA）和Western blotting结果显示重组病毒中PCV2 ORF2基因获得了成功表达。对重组病毒的生物学特性研究表明，重组病毒与其亲本株在不同细胞上的增殖滴度相当，且重组病毒对小鼠无致病性，免疫小鼠后可诱导机体产生抗ORF2蛋白的特异性抗体。【结论】重组伪狂犬病毒构建成功，且表达的ORF2蛋白具有免疫原性。 相似文献
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【目的】反向遗传学技术构建EgM123基因重组狂犬病SRV9病毒疫苗株,研究狂犬病病毒G基因、细粒棘球绦虫EgM123基因、eGFP基因重组质粒在真核细胞中的蛋白表达效果与蛋白免疫原性,为通过反向遗传学拯救eGFP标记EgM123基因重组狂犬病病毒,制备狂犬病-包虫病二联基因重组疫苗提供研究基础。【方法】将已构建的携带eGFP增强型绿色荧光蛋白的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒(3033 bp)利用脂质体转染方法转染BHK-21细胞,使其在BHK-21细胞中表达出融合蛋白,并通过荧光显微镜观察、SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳、Western blotting试验鉴定融合蛋白的荧光蛋白表达、融合蛋白分子量,鉴定其免疫原性。【结果】在转然后48 h可见绿色荧光蛋白的表达;通过SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示,重组质粒在BHK-21细胞中表达获得分子量约为120KDa的融合蛋白;Western blotting结果显示,将蛋白凝胶转移PVDF膜分别经狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体、EgM123多克隆抗体、GFP单克隆抗体分别孵育,均在120KDa处可见抗原抗体结合条带。【结论】eGFP标记的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒在真核细胞中成功表达出融合性蛋白,且具有免疫原性, 相似文献
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【目的】建立CPIV的RT-PCR检测方法。【方法】从临床上疑似犬副流感(CPI)的犬鼻腔分泌物中提取CPIV总RNA。根据Genebank中收录的CPIV(序列号AY581307)中NP基因保守序列,设计一对特异性引物,扩增出667 bp片段,以此建立CPIV的RT-PCR检测方法。【结果】特异性试验表明该引物不能扩增犬其它常见的传染病病毒基因。敏感性试验表明该引物能检测到10~(-6)的CPIV总RNA量。重复性试验表明该引物具有良好的稳定性和重复性。对临床采集的32份样品进行RT-PCR检测时,阳性率为53.12%。【结论】实验建立了CPI的RT-PCR检测方法,可适合于临床CPIV的早期快速诊断和小规模的分子流行病学调查。 相似文献
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【目的】旨在通过构建秦川牛FABP4基因的重组腺病毒载体,为在细胞水平研究FABP4基因的功能和作用机制做准备。【方法】根据GenBank收录的牛FABP4基因mRNA序列设计引物,PCR扩增并克隆测序。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV上并用PmeⅠ线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的E. coli BJ5183感受态细胞进行同源重组,得到重组质粒pAd-FABP4,并用PacⅠ酶切鉴定。将经过PacⅠ线性化的pAd-FABP4转染HEK 293A细胞进行病毒包装和扩增,TCID50法测定病毒滴度。【结果】经测序鉴定本次克隆的FABP4 序列与GenBank收录的一致。 酶切鉴定、绿色荧光观察、PCR及测序检测均证明,重组腺病毒载体构建成功并获得重组腺病毒AD-FABP4,病毒滴度为1.58×109 PFU•mL-1。【结论】成功构建了秦川牛FABP4基因重组腺病毒载体并获得高滴度的重组腺病毒。 相似文献
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【目的】克隆骆驼补体C3d基因,分析序列特征,为其佐剂效应研究提供依据。【方法】利用Trizol试剂,从骆驼肝脏组织提取总RNA,并反转录获得cDNA。设计C3d特异引物,应用PCR技术扩增C3d序列,构建到pMD18-T载体。将重组质粒转入感受态菌株并双酶切鉴定。使用ClustW,DNAstar, Swiss-Model软件对构建的重组C3d基因序列进行同源性比对,建立系统进化树并对其二级和三级结构进行预测和分析。【结果】采用骆驼C3d特异引物,PCR扩增获得大小为909 bp的骆驼补体C3d基因。构建至T载体并转入大肠杆菌,获得阳性转化克隆。克隆的新疆双峰驼C3d序列与骆驼科C3d基因之间的同源性在97%以上,与牛和猪C3d基因同源性为88%,与兔和人的C3d基因同源性为83%。对骆驼C3d蛋白采用Swiss-Model软件进行序列分析,预测该蛋白质的二级结构主要由α-螺旋和β-折叠组成,该蛋白可能具有良好的免疫原性和免疫结合活性。【结论】C3d基因在进化中较为保守,在骆驼免疫中可以采用亲缘关系较近的其他动物来源的C3d作为分子佐剂从而增强骆驼免疫效果。 相似文献
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【目的】对狂犬病毒Rmg基因进行克隆、表达、纯化及复性,以期获得表达量高、反应原性好的Rmg蛋白,为研制快速、直观、简便检测狂犬病毒抗体的胶体金试纸条奠定基础。【方法】用常规PCR从狂犬病毒基因组中克隆出狂犬病毒G蛋白的主要抗原表位基因Rmg,并将其插入原核表达载体pET-Trx中,构建原核表达质粒pET-Trx-Rmg,将pET-Trx-Rmg转化BL21（DE3）plysS,在IPTG诱导下进行表达。【结果】SDS-PAGE分析结果表明,Rmg基因在BL21（DE3）plysS中获得高效表达,表达量占菌体总蛋白的30.5%左右,并主要以不溶的包涵体形式存在,分子量约为51.7 kDa。将表达的蛋白以亲和层析法进行纯化并通过谷胱甘肽还原法进行复性,纯化后蛋白纯度达99.1%。经Western blotting检测,发现表达的Rmg蛋白能够与狂犬病毒高免血清发生特异反应,但与犬细小病毒（CPV）、犬瘟热病毒（CDV）阳性血清不发生反应。【结论】Rmg蛋白具有良好的抗原性,可用于研制检测狂犬病毒抗体的胶体金试纸条。 相似文献
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[目的]通过测定广西流行狂犬病毒糖蛋白(G)基因的全序列,了解广西狂犬病的流行趋势和遗传变异规律,为制定广西狂犬病的防控策略提供科学依据.[方法]2000年10月~2007年10月,从广西14个市采集1569份动物脑组织,经RT-PCR检测及小白鼠脑内接种试验分离狂犬病毒,然后对狂犬病毒G基因进行测序分析.[结果]从广西各地共分离获得26株狂犬病毒野毒株,其中犬23份,牛、猪、猫各1份.狂犬病毒G基因核苷酸全长2067 bp,开放阅读框1575bp,编码524个氨基酸.根据G基因核苷酸同源性及遗传进化树分析结果,可将广西流行的狂犬病毒株分成3个群,Ⅰ群15株,其核苷酸同源性为97.7%~99.9%; Ⅱ群10株,其核苷酸同源性为98.0%~99.9%; Ⅲ群只有1株.通过氨基酸变异分析,了解了26株野毒株G基因编码蛋白的氨基酸突变位点.[结论]广西存在3个群的狂犬病毒野毒株,且以Ⅰ群和Ⅱ群流行为主,3个群的氨基酸变异均呈现明显的特异性. 相似文献
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棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组文库的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】构建棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系的线粒体BAC文库,为研究棉花线粒体基因组结构以及棉花细胞质雄性不育的形成机理提供基础。【方法】在借鉴其它作物的线粒体基因组BAC文库构建方法的基础上,对棉花线粒体DNA的提取及其BAC文库的构建进行探索和优化,构建了棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系的线粒体BAC文库,并采用同源克隆的方法克隆棉花线粒体的功能基因。【结果】构建的不育系和保持系的线粒体基因组文库分别包括2 600个克隆,插入DNA片段大小在10.3 kb和37.5 kb之间,平均分别为22.29 kb和21.36 kb。重组子的覆盖率分别达到棉花线粒体基因组的79倍和76倍。获得了3个棉花线粒体功能基因序列,通过比较,证明晋A不育系与其保持系的这3个基因序列无差异;以这3个基因为探针筛选文库,均获得阳性克隆。【结论】分别构建了棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组的BAC文库。获得了晋A不育系与其保持系的orfB,coxⅠ和nad4L 3个基因的全序列,通过比较,证明晋A不育系与其保持系在orfB、coxⅠ和nad4L基因全序列上无差异。 相似文献
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甘蓝型油菜Polima和Shan 2A CMS的orf224基因的序列分析 总被引：7，自引：0，他引：7
【目的】油菜Polima CMS的线粒体基因组中含有orf224的4.5kb的区段是与细胞质雄性不育相关的，验证Shan2A CMS与Polima CMS在orf224的差异性。【方法】根据orf224设计5′端和3′端的1对特异引物，对Polima CMS和Shan2A CMS的线粒体基因组进行PCR扩增，在Shan2A中得到与orf224同源的DNA片段，对其测序分析。【结果】两序列均由675个碱基组成，核苷酸同源性为99.3％。【结论】证实Shan2A CMS与Polima CMS的orf224基因上存在差异，不能简单的从两者具有共同的恢保关系上说明Shan2A CMS就是已知的Polima CMS。 相似文献