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1.
通过RT-PCR技术从欧鳗(Anguilla anguilla)脾脏总RNA中获得了编码成熟免疫球蛋白(Ig)重链的基因序列(GenBank accession No.GQ249838),该序列长1 686 bp,编码562个氨基酸残基,分子质量为62.2 ku.将该基因片段与pET-his载体连接构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达,其表达产物经SDS-PAGE和Western-blotting分析表明新增的66 ku蛋白条带与预期值相符,且能够与兔抗欧鳗IgM血清发生强烈的特异性反应,证实了欧鳗免疫球蛋白重链(IgH)基因能够在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达;利用荧光定量PCR检测了Ig基因在欧鳗背肌注射山羊IgG前后不同组织的表达水平,结果显示欧鳗在免疫前后其肾脏与脾脏Ig基因的表达量均明显高于其它组织,在鳃、肌肉中的表达量也较高,而在肝脏、心脏中的表达量较低.此外,对同一组织免疫前后的Ig基因表达量比较发现,除肝脏外,其它组织Ig基因表达水平在免疫后均上升,在鳃和肌肉中达到显著水平,而在脾脏中达到极湿著水平. 相似文献
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【目的】克隆猪胸腺活化调节趋化因子CCL17基因,研究其在原核及真核系统中的表达。【方法】提取仔猪脾脏组织总RNA,利用RT-PCR技术扩增CCL17,并将其与已知序列的CCL17进行同源性比较;CCL17基因经测序验证后,将其分别克隆入表达载体pET-32a和pEGFP-C1,构建该基因的重组原核表达载体pET-CCL17和真核表达载体pEGFP-CCL17,分别进行双酶切和测序鉴定;前者在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,后者以脂质体介导法转染至猪血管内皮细胞(SUVECs),通过绿色荧光标记和Western blot检测细胞中CCL17基因的表达水平。【结果】PCR扩增得到CCL17309bp的DNA片段;重组表达质粒pET-CCL17和pEGFP-CCL17经双酶切鉴定和测序分析证明,载体构建成功。pET-CCL17经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析表明,目的蛋白在宿主大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达CCL17融合蛋白,分子质量约32ku,与其理论分子质量基本相符;pEGFP-CCL17转染SUVECs,经Westernblot检测,证实导入的CCL17基因得到了表达。【结论】克隆了猪的CCL17基因,利用大肠杆菌成功表达了CCL17重组蛋白,真核重组质粒在SUVECs中也得到了表达。 相似文献
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鳗鲡疱疹病毒ORF95基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
鳗鲡疱疹病毒(Anguillae herpesvirus,AngHV)是淡水鳗鲡的主要病毒性疾病病原之一。根据鳗鲡疱疹病毒(AngHV-1)的基因组序列(GenBank:NC-013668)设计引物,扩增鳗鲡疱疹病毒福建株(AngHV-FJ)ORF95基因的开放阅读框序列,克隆至pMD19-T载体;经限制性内切酶酶切和测序鉴定,进一步将其克隆至原核表达载体pET-32a,构建了表达质粒32a-ORF95,将其转化表达菌株BL21(DE3),经IPTG诱导,实现了ORF95在大肠杆菌中的高效表达。在0.1mmol.L-1 IPTG、23℃诱导14h的条件下,可溶性ORF95蛋白的表达量较高,经镍柱纯化获得了高纯度的融合蛋白。 相似文献
4.
从麦洼牦牛肾脏组织提取总RNA，以已公布牛 Hoxa10编码区序列设计引物，RT PCR法克隆麦洼牦牛 Hoxa10基因；构建原核表达载体pET 32a(+) Hoxa10，并在大肠杆菌表达系统中表达，SDS PAGE检测融合蛋白；采用RT PCR检测该基因在麦洼牦牛各组织中的表达分布。结果表明：从麦洼牦牛肾脏中克隆 Hoxa10基因的CDs区，大小为285 bp，编码94个氨基酸残基，与牛、猪和绵羊的 Hoxa10同源性高；经IPTG诱导，pET 32a(+) Hoxa10在BL21中可表达1个大小约为28 ku的特异蛋白；在牦牛各组织中，肾脏和肺脏中表达较高，但在心脏表达量极低或不表达。 相似文献
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结合同源克隆和RACE技术克隆大鲵热应激同源蛋白70基因(hsc70)cDNA序列全长,通过半定量PCR方法分析其在大鲵肾脏、脑、肺、皮肤、肝脏、肾脏、脾脏、心脏、肌肉和垂体组织的表达特点。结果表明:大鲵hsc70基因cDNA全长为2 284 bp(GenBank登录号为HM998289),其中3′端和5′端非翻译区分别为87 bp(1~87)和253 bp(2 032~2 284),中间序列即编码区长为1 944 bp(88~2 031),编码647个氨基酸(AA);其核苷酸序列与其他物种相似性最高达83.5%,而编码的氨基酸序列则相对保守,与钝口螈的相似性达94%;根据其编码的AA序列构建进化树,结果大鲵hsc70首先与两栖类物种聚为一类,不同来源的hsc70基因与分类地位相似的物种分别聚类;半定量PCR结果表明,hsc70基因在大鲵的10种组织中都以较高的水平表达,但存在组织差异,在肾脏、脑、肺、皮肤、肝脏、胃、脾脏中表达量相对较高,在心脏中表达量次之,在肌肉和垂体中表达较低。 相似文献
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磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
[目的]检测磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因在大肠杆菌中能否高效表达.[方法]根据GenBank所公布的serC基因序列设计一对特异性引物,以E.coliJM109基因组为模板PCR扩增目的基因片段,将得到的目的基因定向克隆至大肠杆菌/黄色短杆菌穿梭表达载体pEC7中,构建重组表达载体并转化宿主菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析.[结果]通过PCR扩增得到约1 100 bp的DNA片段,经测序后分析该基因与已发表的serC基因具有99.27;的同源性;对重组表达载体进行酶切和PCR方法鉴定正确的命名为pEC7- C;重组表达载体转化宿主菌,SDS-PAGE分析可见约41 kD与理论大小一致的目标蛋白条带.[结论]重组表达载体转化后E.coli BL21中蛋白表达量比原始菌株的蛋白表达量高,证明 serC基因在E.coli BL21(DE3)中成功表达,为进一步构建L-丝氨酸高产基因工程菌奠定了基础. 相似文献
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【目的】克隆了花生(Arachis hypogaea L.)的2个光敏色素基因,并对其进行生物信息学分析,构建这2个基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达蛋白,为进一步纯化蛋白制备抗体以及研究这2个基因在花生发育中的作用奠定基础。【方法】首先,根据花生转录组中编码光敏色素A基因与光敏色素B基因的部分序列,以花生叶片中提取的总RNA为模板,通过RT-PCR与RACE技术对这2个基因的全长ORF序列进行克隆;然后,使用MEGA软件分析花生光敏色素与其他物种中光敏色素的亲缘关系;构建AhphyA、AhphyB的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21并诱导蛋白表达。【结果】2个基因全长ORF分别为3378bp和3 456bp,分别编码1 125和1 151个氨基酸的蛋白;其氨基酸序列与大豆的光敏色素A蛋白和光敏色素B蛋白的相似性分别为88%和90%;经SDS-PAGE检测,在大肠杆菌中2个基因均能受IPTG诱导表达产生蛋白。【结论】利用RT-PCR与RACE技术从花生中克隆得到了2个光敏色素基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。 相似文献
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克隆新疆野生橡胶草顺式异戊烯转移酶基因,对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究该基因的功能和植物体内天然橡胶合成分子机制奠定基础。采用同源克隆法结合RT-PCR技术获得目的基因,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。结果表明:该基因开放阅读框为927bp,编码308个氨基酸,推测的蛋白分子质量为34.9ku,理论等电点为8.74;具有cis-异戊烯基转移酶的5个高度保守区,属于cis-IPPS superfamily蛋白家族;系统进化树表明,橡胶草顺式异戊烯基转移酶与短角蒲公英的亲缘关系最近;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。可见,利用RT-PCR技术从橡胶草叶片中克隆得到顺式异戊烯转移酶基因,成功构建原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到表达。 相似文献
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茶树类黄酮O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达分析 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】克隆茶树（Camellia sinensis） 的一个类黄酮O-甲基转移酶基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究其酶学特性和调控茶树中甲基化类黄酮物质的代谢机理奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以从茶树叶片中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR与RACE克隆技术获得该基因cDNA全长,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。【结果】该基因cDNA全长为1 246 bp,其开放阅读框为1 077 bp,编码358个氨基酸,推测的蛋白分子量为40.2 kD,理论等电点为5.62;其核苷酸编码序列与葡萄和毛果杨的类黄酮O-甲基转移酶基因相似性分别为80%和81%;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。【结论】利用RT-PCR与RACE克隆技术从茶树叶片中克隆得到了一个类黄酮O-甲基转移酶基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。 相似文献