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从小反刍兽疫病毒全长cDNA中对血凝素蛋白H基因进行特异扩增,回收PCR产物分别连接于T载体酶切及测序分析后,将其亚克隆至真核表达转移载体pFastBacHT,经重组筛选获得杆状病毒重组质粒。重组质粒转染sf9细胞后连续传3～4代,分别收获细胞上清及沉淀用于SDS-PAGE及Western blot对重组H蛋白的检测,用抗His蛋白单抗在细胞中检测到H标签蛋白,单抗在细胞及上清中检测到大小为46 ku的融合蛋白。 相似文献
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小反刍兽疫病毒H基因的原核表达与鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中已发表的小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria 75/1株的H基因序列,设计上下游引物并添加BamH I酶切位点,以含有小反刍兽疫病毒H基因的Topo-PPRVH质粒为模板进行PCR扩增,扩增产物克隆于pEASY-T载体中,用BamH I单酶切后将目的片段连接到原核表达载体pET-32a(+)中,核酸序列分析证明.成功构建了PPRV H原核表达质粒pET-32a-H.将pET-32a-H重组质粒转化大肠杆茵 BL21(DE3)进行融合表达.经SDS-PAGE电泳,可见H蛋白获得了高效表达,融合蛋白的分子量约为87 Ku,表达产物以包涵体的形式存在,其表达量达到茵体总蛋白的38%,占包涵体蛋白的80%以上.Western blot鉴定表明,所表达的重组蛋白能被抗组氨酸单抗、抗PPRV标准阳性羊血清及抗PPRV疫苗的羊血清所识别,具有良好的免疫原性. 相似文献
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目的表达小反刍兽疫病毒H蛋白的主要抗原位点用于检测与预防。方法用DNAStar分析小反刍兽疫病毒H基因的主要抗原位点,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从病羊组织中扩增PPRV的H基因的主要抗原位点并克隆到原核表达载体PET-28b中,最后用PCR、酶切和测序分析对重组质粒进行鉴定;将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中,经不同浓度的IPTG诱导表达PPRVH基因的主要抗原位点;用SDS-PAGE和Western-blotting分析所有蛋白的表达。结果将RT-PCR产物电泳,得到与预期大小相符的特异性片段;对重组质粒PET-28b-H66-249和PET-28b-H281-550酶切后,均出现预期相符的片段;DNA测序表明插入片段的序列与小反刍兽疫H蛋白基因完全一致,其大小分别为569bp和831bp;将重组表达的蛋白经SDS-PAGE和Western-blotting检测,证明所有的蛋白均得到表达。结论成功表达了PPRVH基因的主要抗原蛋白,为日后的检测与预防工作奠定了基础。 相似文献
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《中国兽医杂志》2014,(10)
应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达小反刍兽疫病毒西藏分离株Tibet 07的血凝素蛋白,并对其抗原性进行鉴定。扩增小反刍兽疫病毒Tibet 07株H基因,克隆至p Fast Bac/CT-TOPO载体中,构建重组穿梭质粒p Fast Bac-PPRV-H,转化感受态大肠杆菌DH10BacTM,构建重组杆状病毒Bacmid-PPRV-H,转染sf9细胞,通过异源基因重组获得杆状病毒,通过病毒蚀斑试验检测扩增后病毒滴度。将P3代病毒以0.05MOI感染sf9细胞,通过SDS-PAGE鉴定H蛋白的表达,利用Western blot和间接免疫荧光鉴定H蛋白的抗原性。经过PCR、测序等证明重组杆状病毒Bacmid-PPRV-H构建正确。P2代重组杆状病毒的病毒滴度为1×107。表达的H蛋白在相对分子量约68 k Da处可见特异蛋白条带。感染的sf9细胞可与小反刍兽疫病毒H蛋白的单克隆抗体发生特异性反应。表明Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达了小反刍兽疫病毒西藏分离株Tibet 07的血凝素蛋白,为进一步研究其生物学功能及构建检测ELISA试剂盒奠定了试验基础。 相似文献
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目的表达小反刍兽疫F蛋白的抗原位点用于检测与预防。方法用DNAStar分析小反刍兽疫的抗原位点,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从病羊组织中PPRV的F基因的抗原位点并克隆到原核表达载体PET-28b中,最后用PCR、酶切和测序分析对重组质粒进行鉴定;将重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中,经ITPG诱导表达PPRVF基因的抗原位点;用SDS-PAGE和Western-Blotting分析抗原位点蛋白的表达。结果将RT-PCR产物电泳,得到与预期大小相符的特异性片段;对重组质粒PET-28b-F35-111(pZLW013)、PET-28b-F143-485(pZLW014)和PET-28b-F323-485(pZLW015)酶切后,均出现与预期相符的片段;DNA测序表明插入的片段的序列与小反刍兽疫F基因的抗原位点序列分别完全一致,其大小分别为251bp、1053bp和514bp;将重组表达的蛋白经SDS-PAGE和West-ern-Blotting分析,证明小反刍兽疫抗原位点F35-111没有表达、抗原位点F143-485和F323-485得到表达。结论成功表达了PPRVF基因的两段抗原位点蛋白,为日后检测与预防工作奠定了基础。 相似文献
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根据马动脉炎病毒膜蛋白(M)的核苷酸序列，设计合成了1对引物，从pUC18-M质粒中扩增出截短的膜蛋白M基因片段。对该片段及pGEX-6P-1载体双酶切并连接，成功构建了原核表达载体pGEX-6P-Mt。将此重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌，对培养条件及诱导表达条件等影响表达的因素进行了优化；诱导后菌体裂解物经SDS-PAGE分析发现，在约34ku处出现了1条特异性的蛋白条带，其分子质量与预期的M截短蛋白的分子质量相符，并随着诱导时间的延长而变化，在诱导后4h达到高峰。结果表明，膜蛋白M基因截短型在大肠埃希氏菌中得到了高效表达。 相似文献
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以全长PRV基因组DNA为模板,PCR法扩增截短的伪狂犬病毒VP5基因,将其克隆至p ET-28a载体中,构建重组原核表达质粒p ET-28a-VP5,转化至大肠杆菌BL21中,并诱导表达;表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果表明,重组表达蛋白可以与PRV阳性血清及标签HIS单克隆抗体发生特异性反应。通过成功构建了PRV截短VP5基因重组原核表达质粒p ET-28a-VP5,原核表达并纯化了重组蛋白,为伪狂犬病毒特异性诊断抗原的开发、疫苗的研制及细胞生物学研究奠定了基础。 相似文献
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《畜牧与兽医》2015,(8):66-69
利用Bac-to-Bac杆状病毒昆虫表达系统,构建含有小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因的重组质粒F-p Fast Bac HTA,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒F-Bacmid,转染昆虫Sf9细胞,获得含有PPRV F基因的重组杆状病毒。用重组病毒感染昆虫细胞后,SDS-PAGE鉴定出59 ku左右的表达蛋白,Western blot与间接免疫荧光试验(IFA)检测该蛋白具有很好的反应原性。通过免疫BALB/c小鼠,ELISA结果证明F蛋白可以诱导产生高水平的血清抗体;MTT试验结果显示F蛋白能刺激T淋巴细胞增殖;说明表达的F蛋白具有良好的免疫原性。以上研究结果为小反刍兽疫病毒的检测方法及亚单位疫苗的研究奠定基础。 相似文献
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通过将鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus,SVCV)糖蛋白(Glycoprotein,G)基因截短后构建重组表达载体,实现体外高效表达G蛋白,为有关原核诱导蛋白提供参考。以质粒pEGFP-G为模板设计引物,分别扩增G基因的不同片段,与密码子优化后的G基因分别插入pET-32a表达载体,构建重组表达载体pET-32a-GX和pET-32a-OG。经过鉴定后,将重组质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3),通过适宜条件的诱导表达,获得诱导产物并进行SDS-PAGE和Western blotting检测。构建了重组表达载体pET-32a-GX与含密码子优化后G基因的重组表达载体pET-32a-OG;经适宜条件诱导表达了G蛋白后的SDS-PAGE和Western Blotting检测,表明G蛋白成功表达,且含截短片段的重组载体pET-32a-G2的蛋白表达量最高,与原G序列有相同的免疫原性。成功构建截短后的原核表达载体pET-32aGX与密码子优化后的重组表达载体pET-32a-GX,并实现体外大量诱导SVCV的G蛋白。 相似文献
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ZHAO Wen-nian WANG Qing-hua LIU Chun-ju WANG Shu-juan LEI Cheng-hong BAO Jing-yue WANG Zhi-liang 《中国畜牧兽医》2014,41(8):29-33
In order to obtain purified peste des petits ruminants virus F protein, the F gene of peste des petits ruminants virus strain Tibet 07 was cloned into transfer vector pFastBac/CT-TOPO, plasmid pFastBacCT-PPRV-F was then transformed into DH10Bac complement cells. The recombinant bacmid DNA was isolated and transfected into sf9 insect cells to express F protein. The expressed F protein was identified by using SDS-PAGE, Western blotting and indirect immunofluorescence assay. The recombinant F protein was successfully expressed in insect cells with a relative molecular of 59 ku.The sf9 cells infected by Bacmid-PPRV-F can reacted with positive serum of peste des petits ruminants.Using the Bac-to-Bac baculovirus expression system expressed the F protein of peste des petits ruminants virus strain Tibet 07.This work provides basis for development of rapid test for detection of peste des petits ruminants antibody. 相似文献
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Four isolates of peste des petits ruminants virus were obtained from sick Nigerian sheep and goats. One was identical antigenically with the prototype Senegalese strain. A cross relationship was found between peste des petits ruminants virus and rinderpest virus based on neutralisation in vitro. 相似文献
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小反刍兽疫病毒N、H和F蛋白的真核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
目的构建小反刍兽疫病毒(PPRV)H、N、F、NF重组真核表达质粒并观察其在真核细胞内的表达情况。方法采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从病羊组织中扩增PPRV的N、H、F基因序列并克隆到真核表达载体pIRES1neo中,最后用PCR、酶切和序列分析对重组质粒进行鉴定;将重组质粒以磷酸钙介导法转染Vero细胞,用免疫荧光方法鉴定其在细胞中的表达。结果将RT-PCR产物电泳,得到与预期大小相符的特异性片段;重组质粒经pIRES1-N、pIRES1-H、pIRES1-F和pIRES1NF酶切后,均出现预期相符的片段;DNA测序表明插入片段的序列与小反刍兽疫病毒N、H、F蛋白基因序列完全一致,其大小分别为1575bp、1830bp和1641bp;将重组质粒感染真核细胞,经免疫荧光检测,证明所有蛋白均得到表达。结论成功构建了重组真核表达质粒pIRES1-N、pIRES1-H、pIRES1-F和pIRES1NF,为继续进行基因免疫研究奠定了基础。 相似文献
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Virological and serological evidence was obtained to show that peste des petits ruminants virus was widely distributed in Omani sheep and goats. There was no evidence for the concomitant presence of rinderpest virus in these species. Two virus isolates were classified as peste des petits ruminants virus on the basis of their pathogenicity in experimental animals and their specific hybridisation with nucleic acid probes. However, neutralisation tests and polyacrylamide gel analysis of their nucleocapsid proteins showed that they were not identical to the highly conserved African strains of this virus. 相似文献
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The study was aimed to establish a rapid and sensitive diagnostic method for the prevention and control of peste des petits ruminants.In this study,a fragment of PPRV N gene was amplified and cloned into pMD19-T cloning vector.Real-time quantitative PCR assay was performed using SYBR premix Ex Taq.The standard curve was plotted and the specificity,sensitivity and reproducibility of the assay were assessed.The generated standard showed linearity over the entire range from 2.82×100 to 2.82×107 copies/μL with a linear correlation（R2）of 0.992.The specificity of the assay showed that other viruses failed to show an amplification signal.The coefficient of variation（CV）values for intra- and inter-assay variability were low,ranging from 0.27%~2.77% and 0.41%~3.39%,respectively.The lower detection limit,based on plasmid copy number,achieved was 2.82 copies/μL and was 1 000 times more sensitive than conventional PCR assay.cDNA of 12 samples were tested using this method,9 were positive,and 3 were negative.The samples were also tested using conventional PCR,7 were positive and 5 were negative,proving that the two-step SYBR Green Ⅰ based Real-time quantitative RT-PCR assay reported here were more sensitive than conventional PCR.The establishment of this detection method is of great significance to rapid and sensitive diagnosis of peste des petits ruminants and preventing the spread of peste des petits ruminants. 相似文献
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W P Taylor 《Research in veterinary science》1979,26(2):236-242
It was possible to distinguish separate serological responses when experimental goats were inoculated with either rinderpest virus or peste des petits ruminants virus. Examination of field samples established that peste des petits ruminants occur commonly in Nigerian sheep and goats although some villages have escaped recent infection. There was no evidence of infection with rinderpest in these animals. 相似文献