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水稻膜联蛋白基因OsAnn8干旱和低温条件下表达模式以及CRISPR/Cas9定点编辑 总被引：1，自引：0，他引：1
为了阐明水稻膜联蛋白基因家族成员OsAnn8在干旱和低温胁迫条件下的功能作用机制,通过荧光定量PCR技术对不同干旱和低温处理下的水稻叶片中OsAnn8基因进行转录水平上的定量分析,结果表明,OsAnn8基因在干旱胁迫处理前后表达量呈现出高-低-高的变化趋势,而在冷胁迫处理前后表达量则呈现出低-高-低-低的变化。随后,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsAnn8基因进行定点编辑,并借助农杆菌介导将OsAnn8基因靶位点的CRISPR/Cas9基因编辑植物表达载体导入转基因受体品种TP309,经潮霉素筛选后共获得32株转基因阳性植株,靶位点扩增测序峰图分析表明其中的2个单株出现了重叠峰,进一步的T载体克隆分别测序表明,这2个单株为单等位基因敲除,说明本研究已经成功获得了OsAnn8基因靶位点敲除的单等位突变体,不同类型的水稻OsAnn8基因突变体的创建,为水稻膜联蛋白基因家族成员OsAnn8在非生物胁迫条件下的功能研究奠定了材料基础。 相似文献
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《分子植物育种》2021,19(12):3973-3982
水稻雄性不育是杂交水稻杂种优势利用的基础。为了推动粳型第三代杂交水稻育制种技术的发展,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对普通隐性核雄性不育基因RMS2进行定点编辑。根据CRISPR/Cas9基因编辑原理,以RMS2作为靶标基因,在基因第一和第二外显子分别选择正反向靶位点,在NCBI数据库利用BLAST工具分析靶位点特异性,最终构建一个双靶点的CRISPR/Cas9敲除载体。以粳稻品种‘中花11’作为受体,使用农杆菌遗传转化法转化受体获得21株T0代转化苗,通过对潮霉素抗性基因进行检测获得17株阳性苗。对17株阳性苗的2个靶位点分别进行测序分析,有13株在靶位点1发生编辑,突变频率为76.4%。全部植株都在靶位点2被成功编辑,突变频率为100%。不同靶位点发生的突变样式有较大差异。设计InDel标记用于重点株系10的分子标记辅助选择育种,最终获得无T-DNA成分的普通粳稻核不育系。本研究创制的新的rms2突变体和不含转基因成分的rms2粳稻不育系,不仅丰富了rms2的突变类型,也为进一步研究GDSL脂肪酶功能和粳型第三代杂交水稻创制了重要的材料。 相似文献
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肌醇磷酸神经酰胺合酶(inositol phosphoryl ceramide synthase,IPCS)是植物鞘脂合成途径中的一种关键酶,在植物生长发育和逆境适应中具有重要作用。本研究在OsIPCS基因外显子区域设计带有PAM序列的靶位点,利用PCR扩增获得OsIPCS基因sg RNA表达盒,并成功构建CRISPR/Cas9敲除载体;采用根癌农杆菌介导的遗传转化获得3个OsIPCS基因的T0代CRISPR转基因植株;通过PCR扩增和测序确定突变类型,其中2株不同突变类型的OsIPCS1突变单株,27株不同突变类型的OsIPCS2突变单株,9株不同突变类型的OsIPCS3突变单株,为进一步开展OsIPCS基因功能的研究提供科学依据。 相似文献
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CRISPR/Cas9系统在本氏烟草基因敲除中的应用 总被引：1，自引：0，他引：1
《分子植物育种》2017,(1)
CRISPR(clustered regulatory interspersed short palindromic repeat)/Cas9(CRISPR associated proteins)是源于原核生物的一种获得性免疫系统,广泛应用于细菌、真菌、动物和植物的基因编辑研究中。本研究是以转基因本氏烟草16C(16C transgenic Nicotiana benthamiana,16C-NB)为材料,利用CRISPR/Cas9技术实现对其GFP(green fluorescent protein)基因的编辑工作,使用PCR-RE(polymerase chain reaction-restriction enzyme)的方法检测了突变体,建立了本氏烟草CRISPR/Cas9基因敲除瞬时表达系统,进而探讨了CRISPR/Cas9系统在植物基因敲除中的应用。在本研究中,采用In-Fusion克隆技术获得了操作性强的中间载体,针对靶基因GFP设计特定靶位点并进行了基因突变实验,为将来开展其它植物内源基因的生物学功能研究提供了参考。 相似文献
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建立一种高效安全的基因定点编辑体系,为研究植物的光合作用途径以及生理代谢过程提供理想材料。针对拟南芥靶基因ALB3设计2个sgRNA,引导Cas9蛋白识别PAM位点,从而实现ALB3基因的大片段敲除;将荧光筛选标记基因mCherry组装到CRISPR/Cas9载体中,构建一种带有荧光筛选标记的CRISPR/Cas9载体;利用农杆菌转化法转化拟南芥,对其后代进行筛选验证,在倒置荧光显微镜下挑选便可获得Cas9-Free的纯合突变种子。测序结果表明,含有可视化筛选标记基因的拟南芥ALB3基因编辑载体序列与预期一致,由此证明载体构建成功;通过倒置荧光显微镜观察,发现阳性转化拟南芥T_0种子含有红色荧光标记,表观观测以及分子鉴定表明T_1植株得到纯合突变后代,条带大小小于野生型,白化突变性状明显。挑选T_1不含荧光的种子进行培育得到的T_2植株,经分子鉴定发现已成功实现Cas9-Free且植株白化。本研究成功构建了一种带有荧光筛选标记且可实现拟南芥ALB3基因敲除的CRISPR/Cas9载体,并获得Cas9-Free的纯合突变植株,为拟南芥基因高效编辑载体的构建以及Cas9-Free基因编辑后代的获得提供了借鉴与参考。 相似文献
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CRISPR/Cas9基因编辑技术已经成为水稻育种新型手段,香稻育种一直是水稻育种行业的研究热点,水稻香味主要由8号染色体上的甜菜碱脱氢酶基因Badh2控制。为了改良原有品种的香味性状,促进香稻育种的发展,以非香型粳稻品种东农425为试验材料,构建了2个CRISPR/Cas9敲除载体对Badh2基因进行定点编辑,第1个载体(p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA)的2个靶点分别位于第2和第3外显子上,第2个载体(p YLCRISPR/Cas9-B2-gRNA)的2个靶点均在第2外显子上。采用农杆菌介导法对东农425进行遗传转化,成功获得了T0纯合植株,并对其衍生出的T1植株进行T-DNA元件检测,共获得8个突变类型不同且不含有转基因成分的纯合突变株系。同时采用咀嚼法和氢氧化钾浸泡法对这8个纯合突变株系的水稻籽粒进行香味检测,结果表明,8个Badh2株系均具有不同程度的香味,总体上载体p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA编辑的3个株系的香味更为浓郁。对这8个纯合突变株系的主要农艺性状进行考察,发现突变株系的穗数、穗粒数、结实率及千粒质量与野生型相比均没有明显差异。综上,本研究对东农425的Badh2基因成功地进行了编辑,并获得了香味显著提高且无转基因成分的纯合突变体材料,为加快香型粳稻品种的培育提供了技术支持。 相似文献
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为了研究含有多MATH结构域基因的功能,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对拟南芥中两个紧密连锁的功能冗余基因M320(AT2G25320)和M330(AT2G25330)进行共敲除,获得了之前通过杂交无法获得的多MATH结构域基因双突变体材料。通过构建针对M320和M330基因的CRISPR/Cas9共敲除质粒,借助农杆菌介导的浸花法成功转化野生型拟南芥Col-0。最终测序验证显示多MATH结构域基因被成功敲除。M320、M330以及这两个基因同时被敲除的成功率分别是5.13%、17.95%和2.56%;通过测序分析发现突变体共产生了3种可造成移码突变的杂合突变类型:分别为在靶位点插入一个A或T以及缺失一个G。本研究为我们解析多MATH结构域基因的功能提供了材料基础,同时为紧密连锁基因的功能研究提供了创制突变体的有效方法。 相似文献
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《分子植物育种》2020,(16)
为研究水稻抗稻瘟病基因Bsr-d1在杂交水稻恢复系中的功能,我们利用CRISPR/Cas9定点基因编辑方法,设计2个敲除靶标位点,构建了Bsr-d1基因编辑载体,并通过农杆菌介导的方法转化水稻恢复系品种‘GH998’,成功获得了转基因植株,并在T1代筛选到4个无转基因成分的纯合突变株系。纯合突变株系有4种突变类型,包括第199号碱基处缺失17个碱基、第212号碱基处缺失4个碱基、第216号碱基处插入1个碱基、第216号碱基处插入2个碱基突变类型。通过蛋白序列分析,发现纯合突变株系都存在移码现象导致氨基酸变化并提前终止翻译。本研究成功利用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除水稻恢复系‘GH998’中Bsr-d1基因,获得无转基因成分的纯合突变株系,为进一步研究Bsr-d1基因在杂交水稻上的功能提供了理论依据和品种资源。 相似文献
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《分子植物育种》2021,19(8):2596-2602
为了研究铁皮石斛类纤维素合成酶基因的功能和利用类纤维素合成基因培育低纤维素新品种提供基础,本研究通过从铁皮石斛转录组中选取茎中表达量较高的类纤维素合成酶DeCsl4基因,利用CRISPR/Cas9技术构建敲除载体,获得了Csl4基因突变株。测序结果表明,目的基因靶位点序列发现有7个碱基的缺失,其中2个碱基因缺失发生在外显子上。突变植株纤维素含量的测定结果表明,平均纤维素含量(12.95 mg/g)显著低于正常植株(32.16 mg/g),说明DeCsl4基因的突变能降低铁皮石斛茎干中纤维素的合成。本研究结果首次表明CIRISPR/Cas9技术能成功的编辑兰科植物,这为以后研究兰科植物基因功能运用提供技术支撑。 相似文献
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稻瘟病新抗性基因Pi39候选基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
Pi39是位于水稻第12染色体上的稻瘟病新抗性基因,为了明确其功能,本研究利用CRISPR/Cas9系统构建候选基因的敲除载体。通过对候选基因序列分析,将合成的靶位点序列插入入门载体pENTR-sgRNA,再与表达载体Cas9发生重组。本研究首先在候选基因的第一个外显子区域找到了2个带有PAM序列的靶位点,将2个目的小片段依次克隆到pENTR-sgRNA载体上。通过菌落PCR检测及测序,结果表明目的小片段插入位置正确。将入门载体与表达载体进行重组反应后,阳性克隆经菌落PCR和质粒DNA酶切鉴定并测序,结果表明重组载体构建成功。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建敲除载体操作简单,耗时短,为进一步开展Pi39候选基因的功能研究奠定了基础。 相似文献
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SBE3是位于水稻第2号染色体上的水稻淀粉分支酶基因,该基因表达量的降低引起水稻抗性淀粉(resistant starch,RS)含量的提高。本研究应用CRISPR/Cas9系统对SBE3基因进行编辑,根据基因编码区序列(CDS)在第8外显子区域设计长度为20 bp的引导序列,化学合成引导序列并构建成sgRNA,将其插入到Cas9质粒骨架载体中,转化农杆菌。通过农杆菌介导的遗传转化方法将构建好的p CAMBIA1300:SBE3sgRNA:Cas9表达载体转入水稻受体材料沪LPR18中。使用PCR扩增转基因阳性植株中含有CRISPR/Cas9靶点的片段并测序验证,确定12个突变单株,其中2个是纯合型,通过后代分离,得到没有潮霉素基因筛选标记的SBE3纯合突变单株,测定其抗性淀粉含量高达10%以上。以上结果表明,本研究已经通过CRIPR/Cas9技术获得稳定的高抗性淀粉水稻纯合突变体材料,为高抗性淀粉育种提供了新的种质资源和创建方法。 相似文献
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为了获得经济价值更高的香稻品种,利用成熟的CRISPR/Cas9技术,在水稻Badh2基因上设计sgRNA-E2和sgRNA-E3 2个靶位点,对超级稻品种龙粳31的香味品质进行改良,其中靶位点sgRNA-E2跨第2个内含子和第2个外显子,靶位点sgRNA-E3位于第3外显子区。经检测共获得有碱基突变的转基因植株6株,其中2个单株为纯合突变,4个单株为双等位突变。突变类型包括碱基缺失、插入及碱基变异,其中突变单株Badh2-E2-13有大片段缺失,为双等位突变,分别缺失64,108 bp。在转录水平上发现6个突变株系的Badh2基因表达量均比野生型显著降低(P0.05)。通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术检测T_0突变体种子的香味物质2AP含量,发现5个突变单株的2AP含量相对野生型显著提高(P0.05),2个突变单株达到阳性对照(信香粳1号)水平,其中1个相比阳性对照显著提高。通过对6个突变株系的T_1主要农艺性状的调查发现,3个株系在香味物质含量提高的同时主要农艺性状和野生型没有显著差异。进一步对T_1植株进行筛选,共获得了无转基因序列的突变单株10个。综上,利用CRISPR/Cas9技术成功对超级稻品种龙粳31的香味品质进行了遗传改良,实现了香味物质含量的显著提高,为香稻和超级稻的育种提供了基础材料。 相似文献
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《分子植物育种》2020,(11)
OsMADS56是水稻中长日照下的开花抑制基因,与拟南芥中同时影响开花时间和花发育的SOC1同源。为了深入探究OsMADS56基因对水稻开花时间的调控功能,本研究利用反向遗传学的方法通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsMADS56基因设计了2个特异性敲除靶位点,构建了OsMADS56基因敲除载体,并通过农杆菌介导的转化方法成功获得了野生型粳稻9522背景的转基因苗。鉴定结果显示9棵OsMADS56转基因苗中包含了3种纯合突变类型,包括第一个外显子第45号碱基处缺失了一个G碱基、缺失了包含了第一个起始密码子的100个碱基对以及在第5个外显子第322号碱基处插入一个A碱基。通过蛋白序列比对分析,发现这三种类型的突变均造成移码突变和蛋白翻译提前终止引起保守结构域的缺失。本研究获得的水稻OsMADS56基因的三个突变体株系对今后进一步深入研究该基因的功能具有重要意义。 相似文献
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在菜油品质上黄籽相较于褐籽更为优良,且更易于合成高质量的生物柴油。已有研究表明TT1(TRANSPARENT TESTA 1)基因是类黄酮代谢途径中的关键基因,为了通过CRISPR/Cas9基因编辑载体验证TT1基因在白菜型油菜中的功能,本研究先在拟南芥中进行了TT1基因的编辑。构建了CRISPR/Cas9 TT1基因编辑载体,通过农杆菌介导侵染拟南芥花序的遗传转化方式将编辑载体引入拟南芥Columbia生态型,通过表型观察发现T1代12株阳性苗中产生了11株表型株,其中1株表现为褐籽,2株表现为黄籽,9株表现为黄籽和褐籽的嵌合。测序检测分析其突变型结果发现,TT1靶位点处有单碱基缺失、单碱基插入、多个碱基缺失、碱基缺失后插入以及两个靶位点之间多个碱基缺失的多种突变类型。T2代获得一株纯合突变体,TT1两个靶位点之间产生79 bp的碱基缺失,且全株表现为黄籽。本研究为CRISPR/Cas9载体在白菜型油菜中TT1基因功能验证提供借鉴,并为其它作物TT1同源基因的功能验证提供了新的突变体材料。 相似文献
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《华北农学报》2021,36(1)
为了培育耐盐水稻品种,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在水稻品种东农427的耐盐负调控基因OsEIL1和OsEIL2设计1个敲除靶点对其进行同时敲除。通过PCR和测序的方法,在T_0共检测出了5个突变单株,其中有1株为双基因同时突变的植株。在该植株的T_1株系中,获得了4株双基因纯合突变且不含T-DNA元件插入的植株。在T_2进行苗期耐盐性鉴定,成熟期考察农艺性状指标。结果表明,在苗期200 mmol/L NaCl溶液处理5 d后,突变体植株的鲜质量和干质量显著高于野生型植株,地上部及地下部钠离子含量均显著低于野生型植株,钾离子含量与野生型植株无明显差异。恢复7 d后,突变体植株幼苗存活率(75.0%)显著高于野生型植株(8.3%)。在成熟期,突变体的主要农艺性状未发生明显变化。综上,利用CRISPR/Cas9技术对水稻品种东农427进行了耐盐改良,为耐盐水稻品种的培育提供了理论和材料基础。 相似文献
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开花期(又叫抽穗期)影响水稻的产量、品质和地区适应性。在拟南芥中, Cycling DOF Factor 1 (CDF1)蛋白质是CONSTANS(CO)的转录抑制因子,负向调节拟南芥的开花期。但是,水稻中的同源蛋白OsCDF1的功能尚不完全清楚。为了揭示OsCDF1在水稻中的生物学功能及其对开花期的影响,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术设计定向敲除水稻OsCDF1基因的2个靶位点,构建OsCDF1基因的敲除载体;通过农杆菌介导的方法分别转化北方粳稻品种沈农9816,创制OsCDF1基因的突变体;分析沈农9816和oscdf1突变体在田间种植下的开花期和产量性状的差异。主要研究结果为:创制了在第1个外显子的第16bp处缺失5个碱基和在第2个外显子的338bp处单碱基A插入的oscdf1纯合突变。序列比对分析表明,这2种类型的突变均造成移码和蛋白翻译提前终止。在自然长日照条件下, oscdf1突变体的开花期比野生型沈农9816晚4 d以上,其产量高于野生型。对OsCDF1单倍型和单倍型网络分析发现, OsCDF1在不同品种中进化出高度多样性。本研究成功利用CRISPR/Cas... 相似文献