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1.
为了进一步研究分枝酸变位酶同源效应蛋白在核盘菌与植物互作过程中的作用机制,对其启动子进行了克隆和功能分析。采用启动子在线软件Promoter 2. 0和Promoter scan分析分枝酸变位酶同源基因的上游序列,寻找其启动子位点和顺式作用元件,然后通过PCR技术克隆预测启动子的DNA序列,构建荧光蛋白GFP融合载体,转化核盘菌,最后通过检测GFP荧光信号来验证启动子功能。经生物信息学分析发现,该效应蛋白基因上游具有启动子序列特征,包含TATA盒和CAAT盒等顺式元件,采用引物XS1-1和XS1-2进行PCR扩增,得到了733 bp启动子序列,序列包含相关的启动元件,然后以质粒pBlunt NAT-GFP为基础,将经PCR克隆得到的启动子(N-Pro)片段连入载体中,构建得到启动子N-Pro+GFP融合载体,通过REMI技术转化核盘菌原生质体,潮霉素筛选得到了一些转化子,PCR验证融合载体整合到了核盘菌基因组DNA上,最后经荧光显微镜检测到了菌丝GFP荧光信号,结果表明,克隆的分枝酸变位酶同源基因ATG上游733 bp的DNA序列具有启动子功能。 相似文献
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为了研究稻瘟病菌效应蛋白基因功能,本研究构建了稻瘟病菌效应蛋白基因BAS1和BAS4与3×FLAG标签融合的原核表达载体及其与GFP融合的瞬时表达载体。以持有BAS1和BAS4基因的稻瘟病菌株的cDNA为模板,RT-PCR扩增目的基因BAS1和BAS4编码区,选用p3×FLAG-CMV-10为模板扩增3×FLAG基因,分别将BAS1和BAS4与3×FLAG连接到原核表达载体p GEX-4T-1中,获得原核表达载体p GEX-BAS1-3×FLAG和p GEX-BAS4-3×FLAG,测序结果表明克隆到的BAS1、BAS4和3×FLAG序列及连接方向正确。将构建好的原核表达载体转化到表达感受态细胞Transetta(DE3)中得到转化子,利用IPTG诱导表达原核表达产物,SDS-PAGE电泳结果表明,目的蛋白约为40 kD,与理论值相符。为了进一步研究BAS1和BAS4的亚细胞定位,利用同源重组方法构建了pBWA(V)HS-BAS1-GLosgfph和pBWA(V)HS-BAS4-GLosgfp瞬时表达载体。本研究所构建的BAS1和BAS4与3×FLAG融合的原核表达载体及瞬时表达载体将为进一步研究BAS1和BAS4功能及定位提供一定的实验基础。 相似文献
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pCB-zeolin-GFP表达载体的构建及瞬时表达 总被引：1，自引：1，他引：0
为利用荧光蛋白基因GFP检测外源基因在转基因植株中的表达和定位,构建含有GFP基因的植物表达载体pCB-zeolin-GFP。在目的基因的开放阅读框（ORF）两端设计引物,并引入酶切位点和保护碱基,用PCR方法从pDHA扩增得到zeolin基因的全长,克隆到中间载体pMD18-T,分别用NcoⅠ和BglⅡ2种限制性内切酶酶切重组质粒和经过改良的pCAMBIAI1302植物表达载体,经回收、连接、转化、鉴定后,利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞,通过共聚焦显微镜检测绿色荧光蛋白在洋葱表皮细胞中的瞬时表达。构建了zeolin基因与绿色荧光蛋白（GFP）融合的植物表达载体pCB-zeolin-GFP,并在洋葱中得到了表达。构建的融合植物表达载体pCB-zeolin-GFP正确,该载体的成功构建为今后进行基因转移、基因功能研究及培育新品种奠定了基础。 相似文献
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为了便于转基因植株的分子检测,利用重叠延伸PCR（gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR）方法克隆来自于水母的绿色荧光蛋白基因（GFP）和来自于拟南芥的目的基因DREB1C转录因子,并对其进行改造获得融合基因。通过酶切和连接,将融合基因构建到表达载体pCAMBIA1301上,获得了具有DERB1C和GFP基因的重组表达载体pDR1-GFP,酶切和测序结果表明,该融合基因与设计相符。 相似文献
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适于植物转基因体系优化的绿色荧光蛋白表达载体构建及其瞬时表达验证 总被引：1，自引：1，他引：0
在建立和优化植物的转基因体系时,通常期望转化载体同时具有适用植株范围广、尺寸较小、具有多重选择标记或报告基因等优点。为此,通过Gateway技术,构建了含有绿色荧光蛋白基因GFP的植物表达载体pGWB14-GFP,并经PCR鉴定和测序验证了序列的准确性。利用基因枪转化法,将该载体转入洋葱表皮和小麦叶片中,通过荧光显微镜检测,发现绿色荧光蛋白在洋葱表皮细胞和小麦叶片表皮细胞中均能瞬时表达,表明pGWB14-GFP在双子叶和单子叶植物中都能正常发挥功能。本载体在双子叶和单子叶植物植物中都可使用,大小低于17 kb,含有GFP报告基因,具有两套卡那霉素和潮霉素选择标记基因,用于在细菌和植物中筛选,为植物转基因体系的构建和优化提供了功能强大的转化载体。 相似文献
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广谱拮抗菌B96-II的分子鉴定及GFP标记 总被引：3，自引：0，他引：3
用PCR方法扩增的广谱拮抗菌B96-II的16S rDNA经序列测定和BLAST同源序列比较,结合传统的形态观察、生理生化特征鉴定,确定了B96-II分类地位为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).将含有绿色荧光蛋白基因和氯霉素抗性基因标记的大肠杆菌一枯草芽孢杆菌穿梭表达载体(pNW33N-gfp-B96-II-N)通过原生质体法转化B96-II,获得表达GFP的4株标记菌株,在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光.室内平板抑菌试验结果表明,GFP标记对B96-II的广谱抑菌活性没有影响. 相似文献
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转录因子是植物生长发育及其对外界环境的应答反应中起重要作用的蛋白调控因子,一般含有DNA结构域、转录调控域、寡聚化位点和核定位信号。WRKY蛋白是一类具有重要作用的转录调控因子。在水稻的基因组中预测到的WRKY基因多达103个,对这些基因的功能加以注释具有重要的意义。SUSIRI 基因是前人从粳稻日本晴中克隆的一个WRKY家族的转录因子。其开放阅读框长度为1755 bp,可编码584个氨基酸,具有典型的双WRKY结构域。为了进一步研究SSUSIRI 基因,阐明它在水稻中的生物调控功能。通过应用生物信息学的方法,对该基因的预测蛋白进行了结构与功能的分析。利用EBI的interpro数据库分析SUSIRI 基因序列的基序(motif),并结合NCBI的CDD(conserved domains)数据库分析该蛋白的保守结构域,用DNAMAN软件和CBS的TMHMM软件分析蛋白氨基酸残基的亲（疏）水性特点和跨膜结构域,用CBS的Protcomp version9.0软件和Protfun软件分别分析了蛋白的亚细胞定位和功能预测;通过实验设计把SUSIRI基因与GFP基因相融合,构建了由actin启动子驱动的SUSIRI 基因的荧光表达载体pNSUGFP。通过采用基因枪法把该载体转入洋葱表皮细胞进行亚细胞定位鉴定。结果表明,生物信息学预测值显示：SUSIRI 基因具有转录、转录调控、信号转导类功能的可能性最高,预测值分别为0.973、1.598和0.602;同时,其参与翻译功能、中间代谢功能和脂肪酸代谢功能的可能性也较大,预测值分别为4.800、1.490和1.265;由于SUSIRI 蛋白中含有的亲水性氨基酸残基较多,该蛋白不具有跨膜性,是一种非跨膜类蛋白。对其亚细胞定位预测表明：在其氨基酸序列中含有较强的核定位信号,所以定位于细胞核内的可能性很大。进一步用荧光显微镜对基因枪轰击的洋葱表皮细胞的观察发现：对照的GFP蛋白主要沿细胞壁表达,而SUSIRI -GFP融合蛋白在细胞核中有很强的表达。通过试验研究得出：SUSIRI 基因可能是一个参与中间代谢调控功能的基因,主要在基因转录环节发挥作用,是一种核定位蛋白。 相似文献
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马铃薯质体表达载体构建及GFP基因在块茎中的瞬时表达 总被引：2，自引：0，他引：2
利用高等植物质体基因组在进化中高度保守的特点, 根据烟草质体基因组全序列设计合成引物, PCR扩增并克隆了马铃薯质体的trnI-trnA基因片段。将测序正确的trnI基因和trnA基因作为定点整合外源基因的同源重组片段, 构建成包含Prrn-gfp-aadA-TpsbA表达盒的马铃薯质体定点转化载体pBMLSIA-GFP, 酶切鉴定表明, 所构建载体符合预期设计。采用该载体对马铃薯块茎进行基因枪法转化, 结果表明, GFP基因可在质体特异性启动子Prrn及终止子TpsbA的调控下在马铃薯块茎中瞬时高量表达, 经基因枪轰击后马铃薯块茎在紫外投射仪下产生很强的绿色荧光, 在距离为6 cm, 压力1 100 psi轰击2枪的条件下产生的绿色荧光最强。马铃薯块茎可溶性蛋白SDS-PAGE电泳分析表明, GFP蛋白表达量约占总可溶性蛋白的15.4%~30.2%, 均达到了较高的表达水平。该载体对后期马铃薯质体转化体系的建立和其他功能基因导入马铃薯质体进行性状改良具有重要应用价值。 相似文献
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三个烟草品种瞬时表达OsWAK1::GFP的差异 总被引：4，自引：1，他引：3
在研究水稻基因OsWAK1功能的过程中,利用荧光分子标记的方法,将OsWAK1与绿色荧光蛋白GFP构建为融合蛋白,利用注射法使表达OsWAK1::GFP融合蛋白的农杆菌浸入烟草叶片。通过荧光显微观察,根据烟草叶片表皮细胞中是否产生绿色荧光来判断融合蛋白是否表达。研究中同时利用了3个不同的烟草品种,利用同样的方法和操作程序,但是最后根据烟草叶片中绿色荧光的检测结果发现,不同的烟草品种对OsWAK1::GFP融合蛋白的表达差异很大。OsWAK1::GFP融合蛋白能够在心叶烟叶片中表达,却未能检测到其在本生烟和三生烟两个品种的叶片中表达。 相似文献
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水稻稻瘟病是由子囊菌(Magnaporthe oryzae)引起的水稻灾害性病害。培育抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的措施之一。水稻Pi9抗稻瘟病基因来源于小粒野生稻并已被克隆和应用于转基因育种。为了提高无选择标记转基因植株的选择效率,将绿色荧光蛋白(GFP)用作可视遗传标记,对双菌株共转化系统进行改良:目的基因载体携带Pi9抗稻瘟病基因;标记基因载体用潮霉素磷酸转移酶(HPT)作为植物转化选择标记,用GFP作为负选择标记,筛除标记基因分离植株。两种载体的农杆菌转化株混合,分别与水稻品种‘浙恢414’、‘浙粳22’、‘浙11B’、‘日本晴’、‘空育131’和‘粤泰B’的愈伤组织共培养,然后从5%~38.3%的起始愈伤组织筛选获得了转化愈伤组织(HPT+GFP+)。对T0植株进行Pi9基因PCR检测,11.8%~77.8%的T0植株为共转化植株(HPT+GFP+Pi9+)。对共转化植株T1代进行绿色荧光检测,筛选阴性植株(GFP-),再通过PCR筛选Pi9+植株。根据13个T1群体的研究结果,61%的共转化植株在T1代分离出无选择标记转基因植株(HPT-GFP-Pi9+)。转Pi9的无选择标记植株和后代株系对水稻稻瘟病呈抗病反应。因此,本研究通过GFP标记提高了双菌株共转化系统的选择效率,转Pi9的无选择标记水稻株系为水稻抗稻瘟病育种提供了有用的遗传资源。 相似文献
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研究旨在从分子生物学角度研究新城疫病原F基因,探究NDV F基因的遗传变异情况及其蛋白结构。提取新城疫病毒基因组RNA,根据GenBank中已知的NDV La Sota株序列设计引物扩增F基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行鉴定,对鉴定正确的重组质粒pMD-NDV-F进行测序分析。应用生物信息学软件对新城疫病毒F基因进行系统进化树分析、氨基酸序列同源性分析、蛋白结构跨膜区分析及F蛋白三级结构的预测。核苷酸序列测定结果表明：F基因为1792 bp,共编码553个氨基酸;生物信息学分析结果表明：F基因在种属间具有较高的保守性,试验获得的F基因与NDV La Sota、Clone30、V4、B1等弱毒株的一致性较高,具有典型的弱毒株特性,F基因的氨基酸序列与新城疫病毒La Sota株F基因的序列同源性最高可达100%;F蛋白的三级结构预测结果显示：F蛋白部分片段与新城疫病毒F蛋白融合片段的相似性为96%。研究为新城疫病毒的分子病毒学研究奠定了基础。 相似文献
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为了探讨稻瘟病菌热激蛋白MGHSP90的结构特征和性质差异,本研究对MGHSP90热激蛋白进行了生物信息学分析,结果表明,MGHSP90为热激蛋白,属于亲水蛋白、无信号肽、不具有跨膜结构、N-末端具有ATP酶保守结构域。亚细胞定位分析结果表明,该蛋白定位于线粒体。磷酸化位点预测分析结果显示,MGHSP90热激蛋白预测到43个丝氨酸位点,24个苏氨酸位点和10个酪氨酸位点磷酸化位点。本研究为进一步研究稻瘟病菌热激蛋白MGHSP90基因的功能提供了一些参考依据。 相似文献
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哈克尼西棉细胞质陆地棉雄性不育系orf160的克隆及遗传转化 总被引：2，自引：0，他引：2
以哈克尼西棉细胞质陆地棉雄性不育系及其保持系、恢复系为材料,克隆并测序线粒体功能基因的侧翼序列。通过生物信息学分析,在atp4下游发现一个哈克尼西棉细胞质不育系特有的orf160。orf160全长480 bp,N端与atp6序列部分同源,C端序列与核序列部分同源;编码的159个氨基酸序列,与膜蛋白、细胞周期蛋白具有部分同源性。以含有线粒体导肽的GFP瞬时表达载体转化后,在洋葱表皮的细胞膜上观察到绿色荧光,表明线粒体定向载体正常表达。构建酵母和植物表达载体,分别转化酵母、烟草和拟南芥;同对照相比,转基因酵母菌斑畸形且生长缓慢;转基因拟南芥和烟草种子大部分畸形,T1和T2代植株的结实率和种子发芽率降低,花粉着色比野生型浅。结果表明,orf160基因的表达影响受体正常发育。 相似文献
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为了研究玉米蛋白激酶ZmSPK1在植物体内亚细胞水平上的分布情况,利用绿色荧光蛋白基因gfp为报告基因,分别构建了以35S为启动子表达ZmSPK1-GFP融合蛋白和GFP的植物表达载体35S∷ZmSPK1-GFP和35S∷GFP,用花粉浸醮的方法将表达载体转入拟南芥,筛选稳定表达株系,在共聚焦激光扫描显微镜下观察ZmSPK1在植物细胞中的定位。研究结果表明:融合蛋白ZmSPK1-GFP的荧光分布与游离GFP相似,在细胞浆及细胞核内均可见。与单独表达GFP相比,融合蛋白ZmSPK1-GFP在核内信号更强,推测ZmSPK1是可溶性蛋白,定位在核内。 相似文献
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《华北农学报》2021,36(5)
为进一步研究转录因子TCP4在植物生长发育过程中的调控作用和下游靶基因。利用生物信息学分析转录因子TCP4家族及其蛋白序列,扩增AtTCP4基因CDS序列、构建原核表达载体并诱导纯化获得蛋白,利用凝胶电泳迁移试验(EMSA)验证AtTCP4蛋白与拟南芥功能基因LOX2启动子区域的顺式作用元件结合。生物信息学分析表明,拟南芥TCP蛋白含有非典型的螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域;系统进化树表明,AtTCP4属于Ⅱ类TCP蛋白;蛋白三级结构预测表明:转录因子TCP4可以形成同源或异源二聚体。特异性引物扩增获得AtTCP4基因的CDS序列,其开放阅读框(ORF)长为1 263 bp。构建原核表达载体pET-28a-AtTCP4并转化到Rosetta(DE3)感受态中,经IPTG诱导、纯化和Western Blot检测证明获得AtTCP4蛋白。EMSA试验验证AtTCP4蛋白能够结合到功能基因LOX2的顺式作用元件。转录因子TCP4结合功能基因LOX2启动子区域,影响植物激素茉莉酸的生物合成,调控植物的生长发育过程。 相似文献
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为明确羊口疮病毒ORFV129锚蛋白在细胞中的定位,参照GenBank中收录的ORFV SY 17全基因组(登录号:MG 712417.1)序列设计引物,扩增ORFV129基因完整编码框并测序鉴定,利用生物信息学软件分析该基因编码蛋白的氨基酸序列、蛋白跨膜区域,预测其亚细胞定位;并将ORFV129完整基因连接到真核表达载体pEGFP-N1,经双酶切鉴定及测序鉴定是否成功构建重组表达质粒pEGFP-ORFV129;利用LipoGene~(TM )2000介导将pEGFP-ORFV129转染新生山羊睾丸原代细胞,通过Western Blot鉴定ORFV129蛋白是否正确表达,同时,经DAPI核酸染料对细胞核进行染色后,激光共聚焦显微镜观察ORFV129蛋白的亚细胞定位。结果显示,成功扩增ORFV129完整基因,该基因全长大小为1 551 bp,测序鉴定其正确;生物信息学分析发现,其编码516个氨基酸,含有8种锚蛋白ANKs重复基序(ANKs),不存在跨膜区域,亚细胞定位预测其蛋白主要定位于细胞质;Western Blot结果显示,转染了pEGFP-ORFV129重组质粒的山羊睾丸原代细胞中检测到了ORFV129蛋白的表达;亚细胞定位结果表明,ORFV129蛋白主要定位于细胞质,与预测结果一致。研究结果为进一步探明ORFV129蛋白在诱导机体免疫应答中的作用奠定了基础。 相似文献