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1.
建立一种高效安全的基因定点编辑体系,为研究植物的光合作用途径以及生理代谢过程提供理想材料。针对拟南芥靶基因ALB3设计2个sgRNA,引导Cas9蛋白识别PAM位点,从而实现ALB3基因的大片段敲除;将荧光筛选标记基因mCherry组装到CRISPR/Cas9载体中,构建一种带有荧光筛选标记的CRISPR/Cas9载体;利用农杆菌转化法转化拟南芥,对其后代进行筛选验证,在倒置荧光显微镜下挑选便可获得Cas9-Free的纯合突变种子。测序结果表明,含有可视化筛选标记基因的拟南芥ALB3基因编辑载体序列与预期一致,由此证明载体构建成功;通过倒置荧光显微镜观察,发现阳性转化拟南芥T_0种子含有红色荧光标记,表观观测以及分子鉴定表明T_1植株得到纯合突变后代,条带大小小于野生型,白化突变性状明显。挑选T_1不含荧光的种子进行培育得到的T_2植株,经分子鉴定发现已成功实现Cas9-Free且植株白化。本研究成功构建了一种带有荧光筛选标记且可实现拟南芥ALB3基因敲除的CRISPR/Cas9载体,并获得Cas9-Free的纯合突变植株,为拟南芥基因高效编辑载体的构建以及Cas9-Free基因编辑后代的获得提供了借鉴与参考。 相似文献
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《分子植物育种》2020,(16)
为研究水稻抗稻瘟病基因Bsr-d1在杂交水稻恢复系中的功能,我们利用CRISPR/Cas9定点基因编辑方法,设计2个敲除靶标位点,构建了Bsr-d1基因编辑载体,并通过农杆菌介导的方法转化水稻恢复系品种‘GH998’,成功获得了转基因植株,并在T1代筛选到4个无转基因成分的纯合突变株系。纯合突变株系有4种突变类型,包括第199号碱基处缺失17个碱基、第212号碱基处缺失4个碱基、第216号碱基处插入1个碱基、第216号碱基处插入2个碱基突变类型。通过蛋白序列分析,发现纯合突变株系都存在移码现象导致氨基酸变化并提前终止翻译。本研究成功利用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除水稻恢复系‘GH998’中Bsr-d1基因,获得无转基因成分的纯合突变株系,为进一步研究Bsr-d1基因在杂交水稻上的功能提供了理论依据和品种资源。 相似文献
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《华北农学报》2021,36(3)
为研究水稻生长素响应因子OsARF12在水稻生长发育中的作用,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,设计OsARF12 2个不同外显子突变靶点,化学合成包括突变靶点的特异性序列,并与中间载体sgRNA连接进而与Cas9终载体重组获得OsARF12 2个不同突变靶点的表达载体。选取测序成功的单一克隆,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴,获得转基因植株,并结合测序结果分析突变单株的突变类型,T_1突变体KO-ARF12-1有3种纯合突变、2种双等位突变,共5种突变类型;KO-ARF12-2有6种纯合突变、4种双等位突变和1种杂合突变,共11种突变类型。挑选突变类型为缺失1 nt、缺失4 nt、缺失7 nt和缺失2 nt插入1 nt、缺失5 nt的株系作为研究对象,荧光定量PCR鉴定结果表明,OsARF12在突变体中的表达量较野生型极显著下降(P0.01)。在正常大田生长条件下,2种突变体不同突变类型株系与野生型相比,株高显著降低,降幅为13.15%～18.39%;第1,2茎节间长度无显著差异,第3,4茎节间长度显著降低,降幅为21.91%,23.46%。利用CRISPR/Cas9创制的OsARF12突变体,对水稻节间延伸及株高具有一定调节作用,对于完善水稻生长素响应因子的分子调控机制具有重要意义。 相似文献
5.
综合利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和基因芯片技术,聚合主效R基因Pigm和非R基因bsr-d1,以改良优良食味水稻品种水晶3号的稻瘟病抗性。首先利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,以Bsr-d1为靶基因构建重组表达载体并通过农杆菌介导法转化水晶3号,筛选获得无T-DNA元件的bsr-d1纯合突变体,包括T插入、G插入、GA缺失、CGCA缺失和CGCAGA缺失5种突变类型。以无T-DNA成分的bsr-d1纯合突变体为母本、以携带Pigm基因的金玉1号为父本杂交、回交、自交,并利用分子育种芯片同时进行Pigm基因和背景辅助选择,最终获得抗病基因(同时携带bsr-d1和Pigm基因)纯合,且背景回复率均在96%以上的水晶3号改良株系(SJ3-G1、SJ3-G2、SJ3-G3、SJ3-G4、SJ3-G5)。稻瘟病抗性鉴定结果表明,各改良株系对稻瘟病生理小种GUY11的叶瘟抗性与野生型相比均显著提高;接种稻瘟病菌后,改良株系叶片中POD活性显著低于野生型对照,H2O2含量则显著高于野生型对照。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术结合基因芯... 相似文献
6.
本研究利用CRISPR/Cas9技术对水稻OsGPRP家族基因进行敲除,在3个水稻OsGPRP基因的第一个外显子PAM序列区域各设计一个靶位点,并将3个靶位点的sg RNA进行串连,成功构建了3个OsGPRP基因同时敲除的CRISPR/Cas9载体;采用根癌农杆菌介导的遗传转化获得了60株T0代CRISPR转基因植株;通过PCR扩增和测序分析,我们获得了2种不同类型的OsGPRP3单基因突变材料;6种不同类型的OsGPRP2/OsGPRP3两基因突变植株;1种类型的OsGPRP1/OsGPRP3两基因纯合突变植株和4种不同类型的OsGPRP1/OsGPRP2/OsGPRP3三基因突变材料,为进一步研究OsGPRP家族基因的生物学功能及其相互关系提供遗传材料。 相似文献
7.
为建立糯稻品种培育新体系,本试验研究了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对Waxy(Wx)基因定向突变进而培育糯稻的效果。在Wx基因的第2、第7、第8、第10、第11和12外显子区域设计6个靶位点,构建CRISPR/Cas9基因编辑表达载体,采用农杆菌介导法将基因编辑载体转入粳稻品种哈勃601,获得11~88株转基因再生植株。突变分析表明,转基因株突变率总体偏低(0%~30.77%),仅在第2、第7和第11外显子上发生突变,以1~2 bp的插入缺失为主,都为纯合或双等位突变。5份纯合T2突变体的稻米呈蜡质状,直链淀粉含量为由亲本的15.5%降至2.0%~2.6%,接近或达到糯稻水平,其RVA谱与糯稻对照相仿,淀粉粘滞性较亲本哈勃601显著下降。上述结果表明,通过利用CRISPR/Cas9可对Wx基因进行定向突变从而获得糯性材料,但在利用该技术培育新品种时,需要选择适当的靶位点并培育较多的突变体,才能从中选到符合国家标准的糯稻品种。本研究对利用基因编辑技术培育水稻新品种提供了科学依据。 相似文献
8.
CRISPR/Cas9基因编辑技术已经成为水稻育种新型手段,香稻育种一直是水稻育种行业的研究热点,水稻香味主要由8号染色体上的甜菜碱脱氢酶基因Badh2控制。为了改良原有品种的香味性状,促进香稻育种的发展,以非香型粳稻品种东农425为试验材料,构建了2个CRISPR/Cas9敲除载体对Badh2基因进行定点编辑,第1个载体(p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA)的2个靶点分别位于第2和第3外显子上,第2个载体(p YLCRISPR/Cas9-B2-gRNA)的2个靶点均在第2外显子上。采用农杆菌介导法对东农425进行遗传转化,成功获得了T0纯合植株,并对其衍生出的T1植株进行T-DNA元件检测,共获得8个突变类型不同且不含有转基因成分的纯合突变株系。同时采用咀嚼法和氢氧化钾浸泡法对这8个纯合突变株系的水稻籽粒进行香味检测,结果表明,8个Badh2株系均具有不同程度的香味,总体上载体p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA编辑的3个株系的香味更为浓郁。对这8个纯合突变株系的主要农艺性状进行考察,发现突变株系的穗数、穗粒数、结实率及千粒质量与野生型相比均没有明显差异。综上,本研究对东农425的Badh2基因成功地进行了编辑,并获得了香味显著提高且无转基因成分的纯合突变体材料,为加快香型粳稻品种的培育提供了技术支持。 相似文献
9.
肌醇磷酸神经酰胺合酶(inositol phosphoryl ceramide synthase,IPCS)是植物鞘脂合成途径中的一种关键酶,在植物生长发育和逆境适应中具有重要作用。本研究在OsIPCS基因外显子区域设计带有PAM序列的靶位点,利用PCR扩增获得OsIPCS基因sg RNA表达盒,并成功构建CRISPR/Cas9敲除载体;采用根癌农杆菌介导的遗传转化获得3个OsIPCS基因的T0代CRISPR转基因植株;通过PCR扩增和测序确定突变类型,其中2株不同突变类型的OsIPCS1突变单株,27株不同突变类型的OsIPCS2突变单株,9株不同突变类型的OsIPCS3突变单株,为进一步开展OsIPCS基因功能的研究提供科学依据。 相似文献
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《种子》2021,(7)
优质稻米大粒香是采用粳籼杂交方法育成的香稻品系,多年来是贵州省优质稻米企业开发生产的主推品种。但稻瘟病抗性差,限制了其大规模推广应用。本研究以大粒香为材料,根据CRISPR/Cas 9靶点设计要求设计稻瘟病基因pid3特异性靶点sgRNA序列,构建crispr-pid3双靶点载体,通过农杆菌介导遗传转化大粒香愈伤组织,获得45株转基因苗,有30株阳性苗。在T_1代中共获得9株无Cas 9转基因位点的pid3纯合突变体,对其进行稻瘟病病情鉴定,与原种大粒香相比,稻瘟病抗性均有一定程度提高。且对改良株系进行米质鉴定,与野生型大粒香相比,稻米品质并未发生显著改变。说明改良株系的米质并未因pid3基因的编辑而受到影响。 相似文献
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为明确杜梨赤霉素受体(GID1)的生物学功能,以杜梨为试材,通过同源克隆方法得到PbGID1s基因,利用生物信息学分析软件构建基因结构并设计靶位点;利用酶切-连接方法将带有靶点的sgRNA表达盒构建至CRISPR/Cas9表达载体上;通过农杆菌介导方法,将CRISPR/Cas9表达载体转化至杜梨子叶中。结果表明,在杜梨基因组中克隆得到4个PbGID1s,分别命名为PbGID1b-1、PbGID1b-2、PbGID1c-1、PbGID1c-2,基因结构分析显示该家族基因均由2个外显子和1个内含子组成;氨基酸序列比对发现,PbGID1s均具有GID1家族所特有的HGG和GXSXG保守结构域;将含有5个靶位点的sgRNA表达盒成功构建至pYLCRISPR/Cas9P35S-N植物表达载体上,可同时对该家族4个基因进行编辑;杜梨遗传转化试验结果表明,共计浸染595粒杜梨子叶,获得抗性芽176个,阳性植株33株,转化效率达到5.55%。成功构建了可以同时靶向杜梨PbGID1s家族基因的CRISPR/Cas9载体,通过农杆菌介导,成功将该载体转化至杜梨子叶,并获得阳性植株。 相似文献
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microRNA(miRNA)是长度为18~25个碱基的非编码单链RNA,在植物生长发育过程中起着重要的调节作用。水稻是世界上重要的粮食作物之一,近年来调控水稻生长发育的miRNA不断被发掘,但目前关于miR1866的研究还比较少。本研究通过构建miR1866的CRISPR/Cas9表达载体,创制miR1866的突变体,挖掘水稻miR1866的功能。依据CRISPR/Cas9基因编辑技术,设计了miR1866的突变靶点,通过人工合成的方法得到包含突变靶点的特异序列,经过磷酸化修饰和退火后与载体Sg RNA连接进而与Cas9重组得到miR1866的CRISPR/Cas9表达载体,利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴,获得转基因植株,结合测序结果判断转基因植株突变单株的突变基因型。本研究比较了野生型和突变体(KO1866-1-2和KO1866-2-4)在相同培养条件下苗期的根长、株高、茎基粗、鲜重和干重,结果表明:在营养液培养条件下,突变体的株高、根长、茎基粗、鲜重和干重均显著低于野生型。据此推测,miR1866对水稻的生长发育有一定的调节作用。本研究利用CRISPR/Cas9创制水稻miR1866的突变体,对研究miRNA调控途径,完善水稻miRNA调控的分子机制具有重要的意义。 相似文献
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《分子植物育种》2020,(11)
OsMADS56是水稻中长日照下的开花抑制基因,与拟南芥中同时影响开花时间和花发育的SOC1同源。为了深入探究OsMADS56基因对水稻开花时间的调控功能,本研究利用反向遗传学的方法通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsMADS56基因设计了2个特异性敲除靶位点,构建了OsMADS56基因敲除载体,并通过农杆菌介导的转化方法成功获得了野生型粳稻9522背景的转基因苗。鉴定结果显示9棵OsMADS56转基因苗中包含了3种纯合突变类型,包括第一个外显子第45号碱基处缺失了一个G碱基、缺失了包含了第一个起始密码子的100个碱基对以及在第5个外显子第322号碱基处插入一个A碱基。通过蛋白序列比对分析,发现这三种类型的突变均造成移码突变和蛋白翻译提前终止引起保守结构域的缺失。本研究获得的水稻OsMADS56基因的三个突变体株系对今后进一步深入研究该基因的功能具有重要意义。 相似文献
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CRISPR/Cas9系统是一种新型基因编辑工具,准确编辑目标基因,广泛应用于动植物的基因编辑中。本实验构建了油用亚麻品种‘陇亚10号’FAD2基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体,以CRISPR/Cas9基因编辑技术为切入点,根据Gene Bank中公布的FAD2基因序列(DQ222824.1)在FAD2基因外显子部分运用sg RNA在线设计软件CRISPR-P 2.0对亚麻FAD2基因做脱靶分析,在外显子区域选取2个片段作为靶序列进行敲除。以潮霉素作为筛选标记,采用Golden Gate cloning法构建针对‘陇亚10号’FAD2基因的CRISPR/Cas9基因敲除载体,命名为p YLCRISPR/Cas9-FAD2。将pYLCRISPR/Cas9-FAD2载体导入农杆菌并检测其稳定性,保存菌种以便后期利用农杆菌介导法转化‘陇亚10号’,为深入研究亚麻FAD2基因的功能提供参考。 相似文献
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ALOG (Arabidopsis LSH1 and Oryza G1)基因家族成员广泛存在陆生植物中,并在其生长发育的过程中起到关键作用。在水稻ALOG基因家族中总共有10个成员(G1, G1L1～G1L9),G1、G1L5和G1L6已经被证明是影响水稻花发育的关键基因,然而其余7个基因成员的功能还未知。本研究使用CRISPR/Cas9基因编辑系统对水稻ALOG基因家族功能未知的7个成员进行基因敲除,得到它们的突变株系,借此研究它们的基因功能并观察植株表型。在得到的所有T0代突变体植株中,G1L1、G1L2、G1L3、G1L8和G1L9经过测序和解码已经检测到各自纯合的突变株,经过对纯合突变株基因型和氨基酸序列的分析发现,它们各自的序列都发生移码并且编码的氨基酸序列都存在不同程度的突变,说明基因敲除成功。通过对T0代纯合植株的表型观测,我们在G1L1和G1L2的纯合突变株中发现了穗发育缺陷的表型,即主穗轴变长,且上面的小穗变少。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻ALOG基因家族成员进行敲除,为进一步研究水稻发育尤其是水稻花发育调控分子机制提供了重要的遗传材料。 相似文献
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开花期(又叫抽穗期)影响水稻的产量、品质和地区适应性。在拟南芥中, Cycling DOF Factor 1 (CDF1)蛋白质是CONSTANS(CO)的转录抑制因子,负向调节拟南芥的开花期。但是,水稻中的同源蛋白OsCDF1的功能尚不完全清楚。为了揭示OsCDF1在水稻中的生物学功能及其对开花期的影响,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术设计定向敲除水稻OsCDF1基因的2个靶位点,构建OsCDF1基因的敲除载体;通过农杆菌介导的方法分别转化北方粳稻品种沈农9816,创制OsCDF1基因的突变体;分析沈农9816和oscdf1突变体在田间种植下的开花期和产量性状的差异。主要研究结果为:创制了在第1个外显子的第16bp处缺失5个碱基和在第2个外显子的338bp处单碱基A插入的oscdf1纯合突变。序列比对分析表明,这2种类型的突变均造成移码和蛋白翻译提前终止。在自然长日照条件下, oscdf1突变体的开花期比野生型沈农9816晚4 d以上,其产量高于野生型。对OsCDF1单倍型和单倍型网络分析发现, OsCDF1在不同品种中进化出高度多样性。本研究成功利用CRISPR/Cas... 相似文献
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有特殊香味的稻米深受我国消费者欢迎,是优质水稻的重要指标之一,本研究通过基因编辑创制香型优质水稻新种质。水稻中甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2是控制香味的关键基因,以适于直播品种郑稻19为供体材料,利用CRISPR/CAS9技术定点突变水稻Badh2基因。获得T0代转基因阳性植株11株,其中9株子粒有香味,检测6个香型T1株系靶点序列,6个株系均发生突变,发现7种突变类型,5种是缺失类型,2种插入类型,其中3个株系（T1-2、T1-3和T1-7）出现双等位突变。6个T1代株系共测序22个单株,检测到纯合突变10株;T2代检测28株,其中纯合突变21株。以潮霉素抗性基因引物检测T1-2、T1-6和T1-7株系后代单株载体脱落情况,T1代3个株系未获得无载体纯合突变单株,T2代中获得8株无载体纯合突变单株,来源于T1-2株系有3株,来源于T1-7株系5株。T0代9株香型单株子粒2-AP含量1.259±0.072μg/g,T1代8个突变株系2-AP含量0.537±0.111μg/g,均显著高于对照郑稻19。考察中选T1-2、T1-7株系的农艺性状,与郑稻19无显著差异。这些无载体突变单株可作为香型种质在种质创新和育种中应用。 相似文献
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《作物学报》2021,(3)
单向导RNA (sgRNA)是CRISPR/Cas9基因组编辑技术体系的重要元件之一。然而研究显示,很多sgRNA不能有效工作,因此需要对多个设计的候选sgRNA进行筛选,以验证它们的有效性。早期对sgRNA有效性的验证采用的是完整编辑载体瞬时转化原生质体或者叶片的方法。这些方法费时费力,成功率不高,尤其是对于原生质体制备效率比较低的棉花。本研究针对GhMAPKKK2和GhAE基因分别设计靶序列,构建了只转录sgRNA的载体:Gh U6-5P::MAPKKK2-sgRNA-1300和Gh U6-5P::AE-sgRNA-1300,并通过农杆菌注射YZ-1 Cas9转基因棉花植株叶片;与此同时,构建了对应完整的CRISPR/Cas9基因组编辑载体:Gh U6-5P::MAPKKK2-sgRNA-Cas9和Gh U6-5P::AE-sgRNA-Cas9,并通过农杆菌注射YZ-1野生型棉花植株的叶片。另外,针对GhPDS、 GhCLA1、GhMAPKKK2和GhAE基因分别设计靶序列并构建了Gh U6-5P-2::PDS-sgRNA-CLCrVA、 Gh U6-5P-2::CLA1-sgRNA-CLCrVA、Gh U6-5P-2::MAPKKK2-sgRNA-CLCrVA和Gh U6-5P-2::AE-sgRNA-CLCrVA病毒投送载体,通过农杆菌注射YZ-1Cas9转基因棉花植株叶片。以上试验均以转化对应空载体的植株为对照。对转化后的棉花叶片基因组DNA进行PCR扩增后酶切,并对未完全消化的PCR产物进行克隆测序,结果显示,转化Gh U6-5P::AE-sgRNA-1300、Gh U6-5P::MAPKKK2-sgRNA-Cas9、Gh U6-5P::AE-sgRNA-Cas9载体的棉花植株均未检测到靶基因突变,而转化Gh U6-5P::MAPKKK2-sgRNA-1300、 Gh U6-5P-2::PDS-sgRNA-CLCrVA、 Gh U6-5P-2::CLA1-sgRNA-CLCrVA、Gh U6-5P-2::MAPKKK2-sgRNA-CLCrVA和Gh U6-5P-2::AE-sgRNA-CLCrVA载体的Cas9转基因阳性植株基因序列发生了改变,突变类型包括碱基替换、碱基缺失和碱基插入。表明以Cas9转基因阳性植株为转化受体的策略可以高效真实地验证sgRNA的有效性,排除了因转化效率低而带来的假阴性的结果,且病毒载体投送sgRNA的策略更高效、更准确。该sgRNA高效验证体系的建立,为棉花功能基因组学研究提供了重要的技术基础。 相似文献
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水稻香味可显著改善稻米品质,香稻相较于普通稻米更易获得消费者青睐。为快速创制宜直播香型水稻新种质,探索提高豫南地区籼稻稻米品质新途径。本研究以宜直播籼稻品系‘直优151’和粳稻模式品种‘日本晴’为试验材料,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在水稻香味基因Badh2第2和7外显子处分别设计靶序列,构建pC1300-Cas9-E2单敲除表达载体和pC1300-Cas9-E2-E7双敲除表达载体,并分别转化‘直优151’和‘日本晴’。经筛选鉴定共获得21株‘直优151’突变株系和32株‘日本晴’突变株系,包括纯合突变、双等位突变和杂合突变类型。与野生型相比,突变体株系的株高、有效穗数、每穗总粒数、结实率和千粒重均未发生显著变化。使用气相色谱质谱法测定突变株系稻米中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)含量,结果表明,与野生型相比各突变株系2-AP含量均极显著提高。本研究基于CRISPR/Cas9技术成功对水稻香味基因Badh2进行靶向编辑,快速创制了宜直播种植的香型‘直优151’突变株系,为豫南稻区直播籼稻提供了优质香型新种质。 相似文献