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CRISPR/Cas9系统在本氏烟草基因敲除中的应用 总被引：1，自引：0，他引：1
《分子植物育种》2017,(1)
CRISPR(clustered regulatory interspersed short palindromic repeat)/Cas9(CRISPR associated proteins)是源于原核生物的一种获得性免疫系统,广泛应用于细菌、真菌、动物和植物的基因编辑研究中。本研究是以转基因本氏烟草16C(16C transgenic Nicotiana benthamiana,16C-NB)为材料,利用CRISPR/Cas9技术实现对其GFP(green fluorescent protein)基因的编辑工作,使用PCR-RE(polymerase chain reaction-restriction enzyme)的方法检测了突变体,建立了本氏烟草CRISPR/Cas9基因敲除瞬时表达系统,进而探讨了CRISPR/Cas9系统在植物基因敲除中的应用。在本研究中,采用In-Fusion克隆技术获得了操作性强的中间载体,针对靶基因GFP设计特定靶位点并进行了基因突变实验,为将来开展其它植物内源基因的生物学功能研究提供了参考。 相似文献
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CRISPR/Cas9(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat/Cas9)基因编辑技术在生命科学领域掀起了一场重大的技术革命,它比锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)技术更易于操作,而且更高效。CRISPR/Cas9系统已经被广泛应用到植物科学研究领域中。本实验选取拟南芥MS2为目的基因,构建植物基因编辑系统的表达载体,并通过农杆菌介导的方法转化拟南芥,从而利用CRISPR/Cas9系统靶向敲除拟南芥MS2基因。对转基因后代的MS2测序结果分析表明,在获得的12个阳性转化植株中,发现了5个阳性植株存在基因序列上的新碱基插入,由此形成CRISPR/Cas9介导的拟南芥MS2突变体。这一工作为后续分析其他物种中MS2同源基因的功能研究提供参考依据。 相似文献
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【目的】对已克隆的海岛棉U3和U6启动子进行功能鉴定,为构建棉花CRISPR/Cas9多位点基因编辑技术体系提供更多可用的U3和U6启动子。【方法】分别构建以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子驱动sg RNA,以抗旱负调控基因GGB为靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体,然后在新海16的棉花叶片原生质体中进行功能鉴定。通过Polymerase chain reaction方法富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段,并利用PEG瞬时转化法将核心片段转入原生质体中。提取转化后的原生质体基因组DNA,采用酶切/Polymerase chain reaction法分析棉花GGB基因的突变情况并测序验证。最后绘制靶基因突变的频率分布图来计算该CRISPR/Cas9系统的编辑效率和确认突变的真实性。【结果】靶基因测序结果显示靶标位点序列突变的类型全部为碱基替换。【结论】以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子的CRISPR/Cas9基因编辑体系可以成功地定点编辑棉花GGB基因的序列,引起基因突变。 相似文献
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建立一种高效安全的基因定点编辑体系,为研究植物的光合作用途径以及生理代谢过程提供理想材料。针对拟南芥靶基因ALB3设计2个sgRNA,引导Cas9蛋白识别PAM位点,从而实现ALB3基因的大片段敲除;将荧光筛选标记基因mCherry组装到CRISPR/Cas9载体中,构建一种带有荧光筛选标记的CRISPR/Cas9载体;利用农杆菌转化法转化拟南芥,对其后代进行筛选验证,在倒置荧光显微镜下挑选便可获得Cas9-Free的纯合突变种子。测序结果表明,含有可视化筛选标记基因的拟南芥ALB3基因编辑载体序列与预期一致,由此证明载体构建成功;通过倒置荧光显微镜观察,发现阳性转化拟南芥T_0种子含有红色荧光标记,表观观测以及分子鉴定表明T_1植株得到纯合突变后代,条带大小小于野生型,白化突变性状明显。挑选T_1不含荧光的种子进行培育得到的T_2植株,经分子鉴定发现已成功实现Cas9-Free且植株白化。本研究成功构建了一种带有荧光筛选标记且可实现拟南芥ALB3基因敲除的CRISPR/Cas9载体,并获得Cas9-Free的纯合突变植株,为拟南芥基因高效编辑载体的构建以及Cas9-Free基因编辑后代的获得提供了借鉴与参考。 相似文献
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靶向BnSVP的CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术是一种新兴的分子修饰工具,可实现基因组特定位点碱基的缺失、插入或替换,造成基因功能丧失,现已广泛应用于基因功能的研究。为深入探讨甘蓝型油菜中Bn SVP的生物学功能,以中双11号基因组(甘蓝型油菜参考基因组,v4.1)中的4个Bn SVP为靶标基因,并针对不同染色体上的Bn SVP基因,应用CRISPR-P 2.0软件共设计了12条特异sg RNA种子序列,以实现4个Bn SVP同源基因的全部或部分敲除;以p YLCRISPR-Cas9P35S-H为基本载体,以At U3b或At U3d为sg RNA转录启动子,采用Golden gate cloning技术分别组装构建了6个双靶点CRISPR/Cas9植物表达载体。测序结果表明,6个CRISPR/Cas9植物表达载体各sg RNA表达盒DNA序列正确,双靶点组装顺序无误。研究结果为进一步原生质体瞬时表达和农杆菌介导的油菜遗传转化奠定了基础,同时也为应用CRISPR/Cas9基因组编辑系统研究植物多拷贝同源基因的功能提供参考。 相似文献
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《分子植物育种》2017,(6)
CRISPR/Cas系统最早发现于细菌,对入侵的病毒或噬菌体DNA具有免疫作用。基于CRISPR/Cas的免疫机制,设计开发的CRISPR/Cas9基因编辑系统已经成为真核生物基因编辑的主流工具,在拟南芥、水稻等高等植物的基因组功能研究中已经广泛应用。本研究以中国鹅掌楸纤维素合酶(Cellulose synthase,CESA)为研究对象,首次构建了具有表达中国鹅掌楸纤维素合酶(Cellulose synthase,CESA)gRNA(guide RNA)的CRISPR/Cas9基因敲除系统,以LcCESA1基因外显子5'端的第一个外显子区域的GN19NGG序列设计gRNA引物;以p201N-Cas9为载体,Gibson Assembly誖Master Mix为连接酶,通过Gibson Assembly连接技术,将CESA1-gRNA连入p201N-Cas9中,获得p201N-Cas9-CESA1-gRNA载体。根据载体中插入序列,设计了两对检测引物,经PCR鉴定,均获得了相应大小的序列;测序分析进一步证实确认gRNA已经完整准确地连入载体。p201N-Cas9-CESA1-gRNA载体能对CESA1基因进行定向编辑,对后续研究鹅掌楸纤维素合酶的基因功能具有重要意义。 相似文献
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基于棉花U6启动子的海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑体系的建立 总被引：3，自引：0，他引：3
CRISPR/Cas9基因组编辑技术是基因功能研究的一种强有力的工具, 目前已在许多生物体中成功实现内源靶向基因的突变。利用已克隆的海岛棉新海16的2个U6启动子, 分别构建带有新海16内源基因(GbGGB和GbERA1)靶位点DNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑载体。以新海16的胚性愈伤组织为供试材料, 制备海岛棉的原生质体。通过PCR方法大量富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段(包括GbU6::sgRNA和CAMV35S::Cas9两部分), 并利用PEG法转化海岛棉的原生质体。对原生质体基因组DNA进行酶切后PCR, 成功检测到内源靶基因的突变现象。对PCR产物进行克隆测序, 结果显示序列突变的类型主要以碱基替换为主, 少数为碱基缺失。结果表明基于海岛棉U6启动子的CRISPR/Cas9基因编辑系统能在海岛棉中实现靶向基因编辑的功能, 为棉花功能基因组学研究提供了重要的技术基础。 相似文献
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CRISPR/Cas9系统是一项简单、高效的基因定点编辑技术,在植物遗传改良及作物良种选育等方面具有重要的应用价值。本研究主要介绍了CRISPR/Cas9的原理及构建方法,论述了近年来CRISPR/Cas9技术在植物基因功能及基因表达调控、植物基因组的定向编辑以及作物分子育种中的应用及研究进展,分析了该基因编辑系统的主要影响因素及优化改进方式,探讨了该系统在应用中的问题及解决途径并对今后发展方向进行了展望,为该技术在植物基因组定点编辑及作物遗传育种等领域研究提供参考。 相似文献
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CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物基因工程育种中的应用 总被引：2，自引：0，他引：2
《分子植物育种》2017,(7)
作为传统基因工程育种技术,转基因技术在植物分子育种工作中的应用受到技术本身缺陷及其他风险因素的限制。CRISPR/Cas9基因编辑技术是近几年新发展起来的一种基因组定向编辑技术。本研究介绍了CRISPR/Cas9基因编辑技术的基本原理和研究进展,分别比较分析了CRISPR/Cas9系统与前两代基因编辑技术(ZFNs和TALENs)和传统转基因技术之间的差异。至今为止,CRISPR/Cas9基因编辑技术已经在多种植物中实现了定点突变诱导(插入,缺失或修饰等)。由于成本低廉、操作简易和突变诱导率高等特点,CRISPR/Cas9系统作为一项高效植物遗传改良和育种研究的分子操作技术手段,应用前景十分广阔。 相似文献
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稻瘟病新抗性基因Pi39候选基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
Pi39是位于水稻第12染色体上的稻瘟病新抗性基因,为了明确其功能,本研究利用CRISPR/Cas9系统构建候选基因的敲除载体。通过对候选基因序列分析,将合成的靶位点序列插入入门载体pENTR-sgRNA,再与表达载体Cas9发生重组。本研究首先在候选基因的第一个外显子区域找到了2个带有PAM序列的靶位点,将2个目的小片段依次克隆到pENTR-sgRNA载体上。通过菌落PCR检测及测序,结果表明目的小片段插入位置正确。将入门载体与表达载体进行重组反应后,阳性克隆经菌落PCR和质粒DNA酶切鉴定并测序,结果表明重组载体构建成功。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建敲除载体操作简单,耗时短,为进一步开展Pi39候选基因的功能研究奠定了基础。 相似文献
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CRISPR/Cas9基因组编辑技术通过向导RNA的介导和Cas9蛋白的切割来实现对靶基因的定点编辑,由于该技术简便、高效的特点,在作物基因组编辑中被广泛使用。本研究主要对CRISPR/Cas9系统的组成与分类,工作原理以及g RNA构建方法进行了系统的介绍,并针对该系统存在的脱靶效应,总结了相应策略。同时,总结了在作物基因组编辑中CRISPR/Cas9系统的应用及研究进展情况,并对CRISPR/Cas9系统在作物基因编辑研究的方向做了展望,为作物的基因功能研究和分子设计育种提供参考。 相似文献
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CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行定点编辑,为获得基因缺失突变体提供了新的工具。HD-ZipⅢ家族成员REVOLUTA(REV)是植物发育过程中的关键转录因子。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对拟南芥REV进行特异性定点编辑,构建REV基因编辑表达载体,并利用农杆菌介导的花序浸染法将其转入拟南芥。经潮霉素抗性平板筛选和PCR扩增及测序鉴定,获得7棵转基因株系。对转基因植株REV基因的测序结果显示,有3株均成功在靶点1处产生编辑,且其中1株在靶点2处也成功编辑。该基因编辑突变体的获得为后续深入研究REV基因在拟南芥形态发育过程中的作用提供了新的遗传材料。 相似文献
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棉花不同GbU6启动子截短克隆及功能鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件, 而使用较短序列的启动子也是构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的基本要求之一。将已经克隆的海岛棉GbU6-5P启动子(长度为1166bp), 采用Transfer PCR方法成功地截出6个长度不同的U6启动子, 其长度分别为672、468、358、280、202和105bp, 并分别构建了6个启动子驱动的GUS融合植物表达载体。将构建好的6个GbU6-5Ps::GUS-pCAMBIA1300与初始克隆的GbU6-5P::GUS-pCAMBIA1300植物表达载体一起利用农杆菌真空渗透转化法分别转染棉花花粉。GUS组织化学染色显示, 克隆到的7个不同截短大小的GbU6-5Ps启动子均能驱动GUS基因在棉花花粉中转录, 棉花花粉被染成蓝色但颜色深浅存在显著差异。结果显示启动子长度越短, 其转录活性越高。而且另外两种棉花U6启动子GbU6-1P和GbU6-7P也表现出类似的结果。本研究克隆了3个短小的、在棉花花粉细胞中具有转录功能的GbU6启动子。结果显示更短的U6启动子具有更高的转录活性, 而且这一特点在不同U6启动子上具有共性。这预示着使用更短U6启动子不仅符合构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的要求, 而且会提高sgRNA的转录水平, 进而可能提高基因组编辑效率。 相似文献
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CRISPR是细菌或古生菌对入侵到体内的病毒,通过核酸特异性识别、Cas9蛋白酶切割产生的一种天然免疫系统。基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术,通过sgRNA介导和Cas9蛋白切割实现对靶基因的定点编辑。因其操作简便、编辑效率高、适用范围广的特点,迅速成为研究植物、动物、微生物基因功能的重要手段。同时,随着大量基因组信息和相应数据库的广泛建立,CRISPR/Cas9技术利用反向遗传学,配合生物信息技术,成为遗传改良、创新特异种质的一种极有效的新手段。本文主要对CRISPR/Cas系统的基本原理、CRISPR/Cas9基因编辑技术的作用机制,以及CRISPR/Cas9技术在粮油作物遗传改良、品种选育研究中取得的进展进行了综述,为遗传育种工作者利用该技术进行遗传改良和品种优化升级育提供有效的参考。 相似文献
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基于优化sgRNA系统提高海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑功效的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
CRISPR/Cas9基因组编辑体系已经在多种作物中被建立,其最大的优势在于能简单高效定向创制突变体。然而,CRISPR/Cas9基因组编辑体系在实际操作过程中经常会出现没有编辑的情况,或者靶向编辑目的基因的同时也会引发不同程度的脱靶效应,这对CRISPR/Cas9基因组编辑技术的运用带来不利影响。本研究基于前期在海岛棉体细胞中建立的CRISPR/Cas9基因组编辑体系,通过对构建Cas9不同密码子优化方式、不同PAM位点个数和不同靶位点数量的编辑载体,来分析比较编辑效率和脱靶效应的差异。结果表明, 2种Cas9密码子不同优化方式的编辑载体产生的编辑效率和脱靶效应无显著差异;优化后的双PAM位点的编辑效率显著高于单PAM位点,且脱靶效率显著较低;大部分双靶序列编辑效率均高于单靶序列且脱靶效率较低。上述研究结果为今后优化CRISPR/Cas9介导的海岛棉基因组编辑体系奠定了重要的理论依据。 相似文献
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《分子植物育种》2021,19(11):3605-3611
CRISPR/Cas9是实现基因精准突变的有效工具而被广泛应用到功能基因组学研究中。通常需要在已编辑后代的基因组中剔除此编辑体系,以防Cas9进一步编辑导致复杂的脱靶效应。本研究利用可视化的CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除拟南芥AtPAE4基因,测序结果显示AtPAE4在第一个外显子的第478号碱基前面插入了一个碱基A,导致氨基酸的移码突变而提前终止。利用种皮特异启动子控制表达的m Cherry荧光蛋白,可以在T_1代纯合突变体种子群体中分别鉴定出发荧光和不发荧光的种子家系,抗性筛选及分子检测发现不发荧光家系为Cas9-free的AtPAE4突变家系。对AtPAE4突变体的根、茎、叶进行qPCR分析发现AtPAE4在根、茎、叶上的转录水平均显著下调。这些结果表明可视化CRISPR/Cas9系统在基因编辑后代中可快速鉴定到Cas9-free突变体植株,这有助于为进一步研究靶基因功能而获得背景清晰的编辑材料。 相似文献