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为了进一步研究FecB基因,利用PCR-RFLP技术筛选出FecB基因,PCR扩增FecB基因编码区序列1509bp,利用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ定向插入原核表达载体pET30a(+),构建原核表达载体pET30a(+)-FecB,诱导表达纯化重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,WesternBlot检测重组蛋白的免疫活性,ELISA检测抗体效价。结果表明,成功的构建了绵羊FecB基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达目的蛋白,经过4次免疫后,获得多克隆抗体,ELISA方法检测小鼠抗体免疫效价达到1∶32000,纯化的蛋白具有免疫活性。为研究绵羊FecB基因蛋白的功能提供参考。 相似文献
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西红花总苷是栀子果实中的次生代谢产物,具有重要的药理作用,也是国际流行的天然色素"栀子黄"的主要成分。番茄红素β-环化酶b(lycopeneβ-cyclase,LCY b)催化合成了西红花总苷代谢途径的前体化合物-β-胡萝卜素。本研究利用RACE技术,从栀子果实中克隆了一条长1 672 bp的序列,含有一个1 500 bp的开放阅读框,编码499个氨基酸组成的蛋白质。该蛋白具有番茄红素β-环化酶的结构域,分子量为56.39 k D,N端有一个40个氨基酸组成的质体定位的信号肽,属于LCY b亚家族,因此命名为GjLCY b2。进行密码子优化后,利用两种原核表达系统诱导GjLCY b2融合蛋白表达,p SYNO-1系统可以在大肠杆菌中表达出可溶蛋白,p ET-28a(+)系统表达的蛋白以包涵体形式存在。荧光绝对定量q PCR检测结果表明,在栀子果实发育成熟的过程中,GjLCY b2基因的表达量变化与西红花总苷的合成量变化趋势一致,表明GjLCY b2基因可以作为遗传操作的靶点,进行栀子果实中西红花总苷生物合成途径的调控。 相似文献
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《华北农学报》2017,(5)
为明确几丁质酶在鸭梨抗病过程中的作用,以鸭梨为试材,提取总RNA,采用RT-PCR方法克隆几丁质酶基因PbChiⅡ,分析PbChiⅡ在梨黑星病菌诱导下的表达模式,构建原核表达载体pET30a-PbChiⅡ,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达PbChiⅡ蛋白,分析重组蛋白在非生物胁迫下的生长能力。结果表明:PbChiⅡ基因全长(基因登录号:KP876485)969bp,实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)分析显示,PbChiⅡ基因的表达受病原菌的调控,在供试的96h内,梨黑星病菌可诱导该基因表达,且表达量在48h达到最高。将PbChiⅡ基因成功克隆到原核表达载体pET30a上,SDS-PAGE分析表明,该重组蛋白在37℃,1.0mmol/LIPTG诱导2h,表达量最大。转pET30a-PbChiⅡ载体的大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达了分子量约35.53kDa的重组蛋白。诱导的蛋白可增强菌体在NaCl、CuCl_2、CdCl_2和ZnSO_4等非生物胁迫下的生长能力。为进一步探索PbChiⅡ基因的功能提供了基础资料。 相似文献
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为探究三角梅苞片色素的主要组分,以7个不同颜色的三角梅品种为试验材料,采用石油醚-盐酸-氨水反应、显色反应、紫外-可见光谱扫描对其色素进行定性分析,以开花过程中颜色淡化幅度较大的‘金发女郎’和‘变色龙’品种为材料,采用高效液相色谱质谱联用技术对其开花过程中苞片甜菜色素组分进行定量分析。结果表明：除‘白色地毯’苞片色素由叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮组成外,其他6个品种均由叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮、甜菜色素组成。‘金发女郎’花蕾期共检测出甜菜红素9种,盛花期4种,末花期3种,3个阶段含量最多的组分均为5-O-β-槐糖甜菜苷;花蕾期甜菜黄素为3种,盛花期和末花期均4种,其中花蕾期多巴胺-甜菜黄素(I)含量最高。‘变色龙’花蕾期和盛花期甜菜红素为8种,末花期5种,3个阶段含量最多的组分均为5-O-β-槐糖甜菜苷;花蕾期和盛花期甜菜黄素为7种,含量较多的组分均为组氨酸-甜菜黄素和多巴胺-甜菜黄素,末花期8种。综上,三角梅苞片的主要呈色色素为甜菜色素,包括甜菜红素和甜菜黄素,不同品种在开花进程中作用的甜菜色素种类和组分含量不同。本研究为探究三角梅苞片的呈色机制提供了参考,同时也为食品、药品行业筛选... 相似文献
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为了研究红鳍东方 SREBP-1和 SREBP-2基因的功能及在脂肪代谢中的分子机制，从红鳍东方脂肪组织提取总 RNA，反转录获得 cDNA 模板，利用设计的引物 PCR 扩增获得 SREBP-1和 SREBP-2开放阅读框（ORF）， SREBP-1基因 ORF 区的 cDNA 序列长度为3330 bp，编码1109个氨基酸，SREBP-2基因 ORF 区的 cDNA 序列为3444 bp，编码1147个氨基酸。实时荧光定量 PCR 检测 SREBP-1基因在红鳍东方不同组织中的表达特征，结果表明， SREBP-1在脑组织中表达丰度最高，其次为眼、脂肪组织、肠、鳃、脾脏、心脏及肝脏，在肌肉中表达丰度最低。将SREBP-1连接到原核表达载体 pET32a 上，利用 IPTG 对重组质粒 pET32a-SREBP-1在大肠杆菌 Rosetta（DE3）进行诱导表达，SDS-PAGE 电泳显示在141 kDa 处有特异性的条带出现。 相似文献
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为了构建合作猪HMOX1基因过表达载体,并分析其组织表达特征,本研究通过PCR扩增获取合作猪HMOX1基因完整CDS区序列,将其插入到pcDNA3.1(+)过表达载体中,构建pcDNA3.1-HMOX1过表达载体;并通过实时荧光定量PCR检测HMOX1基因在合作猪心、肝、脾、肺、肾、胃、十二指肠和背最长肌中的表达情况。结果显示,成功扩增出合作猪HMOX1基因924 bp的完整CDS区,通过双酶切和测序鉴定,HMOX1基因成功连接到pcDNA3.1(+)过表达载体中。组织表达结果显示,HMOX1基因在合作猪组织中表达量最高是脾脏,显著高于其它组织(P<0.05),其次是肝脏、肺脏、肾脏和心脏,在十二指肠中的表达量最低。研究结果为进一步研究HMOX1基因在合作猪高海拔低氧适应过程中的功能提供了重要参考。 相似文献
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《中国农学通报》2015,(5)
为了研究巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)在植物体内的定殖,利用酶切连接的方法,以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因与表达载体p VLT-33为基本元件,构建了重组表达载体p VLT-EGFP,电转巴西固氮螺菌R7细胞,并利用实时荧光定量PCR(q PCR)研究了不同温度、不同时间EGFP m RNA的表达情况。酶切及测序结果表明,成功构建了p VLT-EGFP载体,并在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达;q PCR结果显示:30℃,诱导9 h EGFP基因的表达水平最高。本研究成功构建了重组表达载体p VLT-EGFP,为实现p VLT-EGFP的可控表达及研究固氮菌在植物体内的定殖规律及促生长机理提供了一种有效的途径。 相似文献
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从红肉火龙果果肉中克隆得到3个ERF转录因子,命名为HpERF1/2/3。氨基酸序列比对和进化树分析发现HpERF1/2/3具有典型的AP2/ERF结构域,ORF长度分别为1 020、843、1 269 bp,编码长度分别为339aa、280aa、422aa,分子量为37.4、31.99、45.08 k Da,以及等电点为5.69、6.36、6.93的氨基酸多肽链。实时荧光定量聚合酶链式反应表明,随着红肉火龙果果实发育,HpERF1/2/3基因的表达明显增强。亚细胞定位和转录活性分析显示HpERF1/2/3都定位于细胞核,是核蛋白,并且具有转录激活活性。双荧光素酶瞬时表达分析显示,HpERF1/2/3可以激活红肉火龙果甜菜红素合成途径上关键基因HpCyt P450-like1的启动子活性。这些结果表明HpERF1/2/3可能通过调控甜菜红素合成相关基因表达来参与红肉火龙果果实品质形成过程,加深了对红肉火龙果果实品质生物学的认识。 相似文献
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GA信号转导途径是通过DELLA蛋白来抑止的。通过对Genbank进行Blast比较,我们首次克隆了棉花DELLA蛋白基因,长度为1644bp,分离的棉花DELLA蛋白进行生物信息学分析显示,该蛋白具有与拟南芥中的DELLA蛋白一样的保守结构域,我们对克隆的基因进行原核表达研究,将克隆的基因转化原核表达载体pET22b,在E.coli BL21（DE3）菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhRGL蛋白, 大小约为64kDa。首次实现了棉花DELLA蛋白基因在原核系统中的表达, 为棉花DELLA蛋白的抗体制备及其表达定位研究奠定了基础。 相似文献
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为了研究甜菜M14品系BvM14-Tpx基因的抗氧化功能,本试验以带有野生白花甜菜第9号染色体的单体附加系M14品系为试验材料,利用RACE技术获得甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因(BvM14-Tpx) cDNA全长,对其进行生物信息学分析,利用Real-time PCR和半定量RT-PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析,在原核表达体系下进行BvM14-Tpx基因应答氧化胁迫研究。生物信息学分析结果表明,BvM14-Tpx基因cDNA全长为1044 bp,包含最大的ORF为489 bp,编码162个氨基酸;含有过氧化物酶Ⅱ(PrxⅡ)型的保守结构域;BvM14-Tpx蛋白与豌豆(Pisum sativum L.)和苜蓿(Medicago truncatula L.)中Tpx蛋白的亲缘性较高。组织特异性表达分析结果表明,BvM14-Tpx基因在甜菜M14品系各组织表达量从高到低的顺序是根、茎、叶、花。通过原核表达体系下BvM14-Tpx基因应答氧化胁迫的研究,表明BvM14-Tpx基因能够提高大肠杆菌对于环境中氧化胁迫的适应能力,减轻H2O2对细菌生长的抑制。本研究对挖掘甜菜M14品系优质基因,提高甜菜对于非生物胁迫的抗性以及开展甜菜遗传改良工作具有重要意义。 相似文献
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对苏云金芽孢杆菌Cry1Ab野生型基因的编码区序列进行改造,以获得密码子优化的抗虫基因,构建原核表达载体后,将重组载体转入大肠杆菌进行诱导表达并对诱导蛋白进行抗虫试验。首先根据植物密码子的偏好性及使用频率,优化、改造并人工合成了Cry1Ab基因,序列分析表明：改造后的Cry1Ab基因全长1848 bp,与原始序列同源性为66%,G+C含量由原来的37.34%提高到63.04%。将改造后的Cry1Ab基因与原核表达载体pET28b(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),阳性菌液进行诱导表达后,SDS-PAGE分析结果显示： Cry1Ab蛋白在BL21(DE3)细胞中得到高效表达,分子量为70 kDa。喂虫试验结果表明：诱导表达的蛋白对玉米螟具有很强的毒性,幼虫死亡率达到93．33%,而且,存活的玉米螟生长发育也受到明显抑制。该抗虫基因可以作为培育转基因抗虫作物的候选基因。 相似文献
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甜菜M14品系BvM14-STPK基因的生物信息学分析及响应盐胁迫的表达分析 总被引：1，自引：1，他引：0
旨在进一步研究BvM14-STPK蛋白激酶对盐胁迫的应答反应,本研究以甜菜M14品系为材料,使用特异性引物通过聚合酶链式反应进行扩增,获得BvM14-STPK基因cDNA全长,并进行生物信息学分析,采用荧光定量PCR探究该基因响应盐胁迫的表达分析。生物信息学分析结果表明,BvM14-STPK基因cDNA全长1668 bp,包含1527 bp的最大ORF,编码508个氨基酸;BvM14-STPK蛋白激酶具有典型的蛋白激酶保守结构域。实时荧光定量PCR结果表明,BvM14-STPK基因在甜菜M14品系叶、根中均有广泛表达,叶中的表达量高于根中。该基因在200、400 mmol/L NaCl处理下,在叶片和根中呈现不同的表达状态,表明该基因可以应答盐胁迫,但在不同组织中应答盐胁迫的表达量存在差异。本项研究在挖掘甜菜M14品系优质基因和提高栽培甜菜抗逆性等方面具有重要指导意义,为进一步开展甜菜遗传改良工作奠定基础。 相似文献
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内蒙古羊源细粒棘球蚴Eg95基因原核表达及蛋白鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
在克隆内蒙古羊源细粒棘球蚴疫苗候选基因Eg95的基础上,构建原核表达载体pET-Eg95并转化E.coli BL21(DE3),优化表达体系,获得Eg95纯化蛋白.将Eg95基因从克隆质粒pMD19-T-Eg95亚克隆到原核表达载体pET44a(+)上,构建原核表达载体pET-Eg95,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,优化表达条件.纯化的 Eg95 融合蛋白经 SDS-PAGE和Western Blot鉴定其正确性和免疫学活性.原核表达载体pET-Eg95在大肠杆菌中高效表达,优化的原核表达条件为:当菌液OD600值为0.6时,加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG,37℃,振荡培养5 h.纯化后的蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定为目的蛋白并具有生物学活性.原核表达载体pET-Eg95构建正确并可高效表达可溶性Nus-Eg95融合蛋白,可作为特异性抗原应用于免疫印迹法检测血清抗体. 相似文献
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为了研究巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）在植物体内的定殖,利用酶切连接的方法,以增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因与表达载体pVLT-33为基本元件,构建了重组表达载体pVLT-EGFP,电转巴西固氮螺菌R7细胞,并利用实时荧光定量PCR (qPCR) 研究了不同温度、不同时间EGFP mRNA的表达情况。酶切及测序结果表明成功构建了pVLT-EGFP载体,并在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达;qPCR结果显示：30 ℃,诱导9 h EGFP基因的表达水平最高。本研究成功构建了重组表达载体pVLT-EGFP,为实现pVLT-EGFP的可控表达及研究固氮菌在植物体内的定殖规律及促生长机理提供了一种有效的途径。 相似文献
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含铁蛋白cyb5融合基因莱茵衣藻核转化表达载体的构建及转化 总被引：1，自引：1，他引：0
旨在构建并转化细胞色素cytb5基因的衣藻核转化表达载体,为其在衣藻叶绿体中对铁的利用情况研究奠定基础。将克隆的PsaD信号肽、细胞色素b5和增强型绿色荧光蛋白基因的基因融合,插入到pDBle载体中;采用玻璃珠法,将重组子导入莱茵衣藻(CW15)中;经博来霉素筛选获得转基因植株并鉴定。本项研究通过分子克隆技术获得了衣藻自身来源的PsaD信号肽、裂殖酵母来源的细胞色素b5和常用增强型绿色荧光蛋白基因片段;重组质粒pDBle-b5、pDBle-bG和pDBle-TbG测序完全正确;经博来霉素抗性筛选,获得转化衣藻单克隆;通过PCR检测转化衣藻基因组DNA,扩增片段与预期相符。实验结果表明,成功构建了pDBle-b5、pDBle-bG和pDBle-TbG衣藻核转化表达载体,重组质粒已整合到莱茵衣藻基因组中。 相似文献
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TA克隆构建含MOC1基因cDNA片段的重组质粒,作为TaqMan定量检测水稻分蘖基因MOC1 mRNA的标准品,建立了检测方法。采用RT—PCR。的方法,从水稻分蘖芽总RNA中逆转录扩增总cDNA,PCR扩增MOC1基因中设计的目的片段,将纯化的目的片段与pMD19-T Simple载体连接,转化宿主菌JM-109,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析。纯化质粒并检测260nm吸光值,确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。对重组质粒进行实时荧光定量PCR实验。建立了MOC1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达10^2拷贝,线性范围为10^2-10^7拷贝,阈值循环数与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（r=0．999）,扩增效率高（E=92．8％）。成功建立了MOCI基因实时荧光PCR定量标准品,且TaqMan荧光定量RT—PCR的方法可对水稻分蘖基因MOC1 mRNA的表达进行准确定量。 相似文献
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《分子植物育种》2015,(12)
本研究从陆地棉耐盐品种中9 409中克隆得到线粒体基因rps12(ribosomal protein S12,30S核糖体蛋白S12),并对该基因进行生物信息学、实时荧光定量PCR和原核表达分析。结果表明:陆地棉线粒体基因rps12的ORF全长为372 bp,编码123个氨基酸,分子量约为14.102 k D,等点电为11.11。rps12基因的表达具有组织特异性,且受盐胁迫诱导。另外,在大肠杆菌BL21中,重组原核表达质粒p ET28a-rps12可经IPTG诱导表达。研究结果为今后进一步研究陆地棉线粒体基因rps12的功能和应用奠定了分子生物学基础。 相似文献
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樱桃病毒A外壳蛋白基因克隆及其原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
为制备樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)抗血清,克隆CVA外壳蛋白基因(CP),构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。根据CVA全基因组序列(NC_003689.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增CVA外壳蛋白基因,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-CVACP,转化大肠杆菌BL21(DE3)株系,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。序列分析显示,该区段长为603 bp,编码201个氨基酸,与法国分离物PF(HQ267856.1)的同源性为96.8%,与印度分离物JKSPMi-5(FN669548.1)同源性为86.3%。成功构建了原核表达载体pET30a-CVACP,SDS-PAGE电泳分析显示,转pET30a-CVACP载体的BL21(DE3)菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白,该重组蛋白在37℃、1.5 mmol/L IPTG、诱导4 h条件下表达量最大。 相似文献