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腊梅花水通道蛋白CpTIP基因甘露糖筛选体系植物表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]构建以甘露糖为筛选剂的抗旱、抗盐碱植物表达载体,进一步选育无标记的抗逆作物品种。[方法]利用腊梅花水通道蛋白CpTIP cDNA和大肠杆菌pmi基因构建植物表达载体,将抗逆基因与甘露糖正向选择系统结合。[结果]成功构建了腊梅花水通道蛋白印肿基因甘露糖筛选体系植物表达载体pPMI：：CpTIP。[结论]所构建的载体结合了抗逆基因和甘露糖正向选择系统的优点,将抗逆基因与环境友好型筛选体系很好的结合起来。 相似文献
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新型筛选标记磷酸甘露糖异构酶基因在转基因植物中的应用 总被引：1，自引：0，他引：1
广泛应用于植物遗传转化的抗生素和除草剂选择标记对环境生态和人类健康可能具有潜在风险,因此生物安全筛选标记已成为当前植物转基因研究的热点。磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)是一种新型生物安全选择标记基因,全面介绍了其作用原理、生物安全性、在植物转化中的应用与检测等,深入分析了其在植物转化中作为筛选标记存在的问题与不足,并就其发展前景进行了展望,以期为在转基因植物中的广泛应用奠定基础。 相似文献
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选择标记基因(Selectable marker genes,SMGs)为目前应用体细胞核移植技术制备转基因家畜所必须.然而一旦完成筛选得到所需要的转化细胞或完成转基因动物的构建之后,SMGs就变成不需要的或多余的,而且这些带有标记基因的家畜还存在安全方面的隐患.因此,建立无选择标记的转基因家畜技术势在必行.目前能够采取的策略一是在筛选转化细胞或构建成功目的基因表达的家畜之后,删除SMGs;二是使用无筛选标记的转基因技术.综述了应用Cre/LoxP位点特异性重组系统删除SMGs的各种方法,以及应用锌指核酸酶(ZFNs)、TALEN和CRISPR/Cas9等新型基因编辑技术,基于受精卵显微注射的无筛选标记转基因技术的研究进展,分析对于制备无SMGs的转基因家畜而言后者的优势所在,旨在为转基因家畜研究提供参考. 相似文献
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[目的]建立一种快速、高效的甘露糖安全筛选体系。[方法]以绿色荧光蛋白（GFP）编码基因为报告基因,用农杆菌介导的方法将磷酸甘露糖异构酶基因（pmi）转入水稻品种皖粳97,并对转化和筛选条件进行优化。[结果]受体品种皖粳97,在32oC光照条件下诱导愈伤的出愈率可达90．3％,且生长较快;培养基中甘露糖筛选压力以5∥L蔗糖＋15g／L甘露糖较为适宜,在该条件下筛选21d,进而分化成苗。转化频率可达20．6％。[结论]该研究确立的甘露糖筛选体系,能明显缩短筛选周期、提高转化效率,有利于转基因水稻的安全生产。 相似文献
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《云南农业大学学报(自然科学版)》2021,(4)
【目的】建立以日本晴愈伤组织为受体、草甘膦抗性基因CP4为选择标记基因的高效水稻遗传转化体系。【方法】以粳稻日本晴的成熟胚为试验材料,通过农杆菌介导法,将含有草甘膦抗性基因CP4的P1300载体转化日本晴的愈伤组织,分别用质量浓度为10、20和40 mg/L的草甘膦进行3轮抗性筛选,诱导分化和再生成苗;利用1 000 mg/L草甘膦对移栽成活的阳性苗进行抗性鉴定。【结果】获得145株转基因幼苗,PCR检测阳性株为128株,阳性率达88.27%;经过3轮抗性筛选后,转基因幼苗的阳性率提高;移栽成活的99株阳性苗中,65株表现为抗性,抗性率为65.66%。【结论】成功建立了以草甘膦为筛选标记的水稻转基因体系,该体系为水稻育种提供了材料,并对以抗草甘膦基因作为筛选标记的水稻转基因和一些基因功能验证提供了技术支持。 相似文献
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【目的】在番茄中表达人成纤维细胞生长因子-21(Fibroblast growth factor-21,FGF21),为利用植物反应器规模化生产FGF21奠定基础。【方法】以甘露糖-6-磷酸异构酶基因(pmi)作为转基因植物的选择标记,将人源fgf21基因克隆至表达载体pCAMBIA1390RⅡ(简写为p1390RⅡ)上,构建重组表达质粒p1390 RⅡMFGF21。采用冻融法将质粒p1390RⅡMFGF21转入根瘤农杆菌EHA105,叶盘法转化番茄(Lycopersicon esculentum)"中蔬6号",采用PCR检测、Southern杂交筛选转基因番茄阳性植株,并对FGF21蛋白在转基因番茄叶片中的表达进行了Western blot分析。【结果】成功构建了带pmi安全选择标记基因的植物双元表达载体p1390RⅡMFGF21,在番茄中初步建立了以pmi为选择标记基因的遗传转化体系,共获得了26株转基因番茄植株,其中5株为阳性克隆,转化率为19.2%。采用PCR扩增和Southern blot分析进行检测,结果表明,重组fgf21基因已整合到转基因番茄基因组中。Western blot分析检测结果显示,FGF21蛋白在转基因番茄叶片中有一定水平的表达,并具有良好的抗原性。【结论】获得了以pmi为选择标记成功表达FGF21蛋白的转基因番茄遗传体系。 相似文献
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[目的】构建以甘露糖为筛选剂的抗旱、抗盐碱植物表达载体,进一步选育无标记的抗逆作物品种。[方法]利用腊梅花水通道蛋白CpTIP cDNA和大肠杆菌pmi基因构建植物表达载体,将抗逆基凶与甘露糖正向选择系统结合。pmi基因植物表达载体（pPMI）的构建：用XhoI酶切植物表达载体pCAMBIA2301,切除Kan基因,并用CIP酶进行去磷酸化,然后与XhoI酶切后PCR产物连接转化。腊梅花水通道蛋白CpTIP基因甘露糖筛选体系植物表达载体（pPMI：：CpTIP）的构建：用和nI和Xbal酶切pPMI植物表达载体和克隆载体,并将酶切后pmi植物表达载体与腊梅花水通道蛋白CpTIP基因连接转化。转化鉴定均按Sambrook等的方法进行。[结果]成功构建了腊梅花水通道蛋白CpTIP基因甘露糖筛选体系植物表达载体pPMI：：CpTIP。[结论]所构建的载体结合了抗逆基凶和忖露糖正向选择系统的优点,将抗逆基因与环境友好型筛选体系很好的结合起来。 相似文献
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融合杀虫基因对甘蔗的遗传转化 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]利用MAR序列介导转基因表达及融合杀虫基因,以期克服外源基因失活,增强抗虫基因表达能力,延缓昆虫抗性的发生,获得高抗虫转基因甘蔗植株.[方法]以甘蔗品种ROC25为材料,进行愈伤组织、芽苗分化和生根的Hyg抗性筛选试验.利用农杆菌介导,将含MAR序列介导融合杀虫基因(AVAc-CpTI)导入甘蔗基因组.[结果]愈伤组织增殖、出芽时Hyg的最佳筛选浓度为50 mg/L,生根时Hyg的最佳筛选浓度为30 mg/L.获得13个MAR序列介导转基因表达基因系,48株Southern杂交阳性甘蔗植株;获得8个无MAR序列介导转基因表达基因系,7株Southern杂交阳性甘蔗植株.MAR序列介导转基因表达使转化过程中转基因系的获得数量提高了62.5%.[结论]建立了ROC25的潮霉素抗性筛选体系;MAR序列介导融合杀虫基因进行甘蔗遗传转化,可提高甘蔗外源基因转化效率. 相似文献
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【目的】利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)油体系统表达人成纤维细胞生长因子-21(Fibroblastgrowth factor-21,FGF21),为利用植物油体表达系统规模化生产FGF21奠定基础。【方法】以磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因作为转基因植物的安全筛选标记,将带有组氨酸标签的人源FGF21基因与大豆油体蛋白基因融合,克隆至大豆油体蛋白启动子驱动的表达载体pCAMBIA1390MDo(p1390MDo)上,构建植物双元表达载体p1390MDoFGF21。采用冻融法将植物双元表达载体p1390MDoFGF21转入农杆菌GV3101,花粉管导入法转化拟南芥,采用PCR检测、Southern blot筛选转基因拟南芥阳性植株(T0),并对FGF21蛋白在转基因拟南芥种子(T1)中的表达进行Western blot分析。【结果】成功构建了带PMI安全筛选标记的植物双元表达载体p1390MDoFGF21。PCR扩增和Southern blot分析结果表明,重组FGF21融合基因以单拷贝和多拷贝2种方式已整合到转基因拟南芥基因组中。BandScand 5.0软件和Western blot分析结果显示,FGF21融合蛋白约占转基因拟南芥种子可溶性蛋白的3.76%,并具有良好的免疫原性。【结论】FGF21融合基因已经转入拟南芥中,并在以PMI为选择标记的转基因拟南芥种子中成功高效表达。 相似文献
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【目的】在番茄中表达人成纤维细胞生长因子-21（Fibroblast growth factor-21,FGF21）,为利用植物反应器规模化生产FGF21奠定基础。【方法】以甘露糖-6-磷酸异构酶基因（pmi）作为转基因植物的选择标记,将人源fgf21基因克隆至表达载体pCAMBIA1390RⅡ（简写为p1390RⅡ）上,构建重组表达质粒p1390 RⅡMFGF21。采用冻融法将质粒p1390RⅡMFGF21转入根瘤农杆菌EHA105,叶盘法转化番茄(Lycopersicon esculentum)“中蔬6号”,采用PCR检测、Southern杂交筛选转基因番茄阳性植株,并对FGF21蛋白在转基因番茄叶片中的表达进行了Western blot分析。【结果】成功构建了带pmi安全选择标记基因的植物双元表达载体p1390RⅡMFGF21,在番茄中初步建立了以pmi为选择标记基因的遗传转化体系,共获得了26株转基因番茄植株,其中5株为阳性克隆,转化率为19.2%。采用PCR扩增和Southern blot分析进行检测,结果表明,重组fgf21基因已整合到转基因番茄基因组中。Western blot分析检测结果显示,FGF21蛋白在转基因番茄叶片中有一定水平的表达,并具有良好的抗原性。【结论】获得了以pmi为选择标记成功表达FGF21蛋白的转基因番茄遗传体系。 相似文献
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稻瘟病是水稻上最重要的病害之一.本研究所用Pi-ta+基因是一个来自景洪直立型紫秆普通野生稻的基因,该基因属于稀有的抗稻瘟病Pi-ta+等位基因,具有抗稻瘟病的能力;几丁质酶是一种以几丁质为底物的水解酶,它可以降解病原真菌细胞壁中的几丁质,破坏细胞新物质的沉积使病原体死亡.为获得抗稻瘟病的水稻新材料和进一步培育聚合多个抗稻瘟病基因的转基因水稻新品种,本研究采用一种新的方法构建了Pi-ta+和Bchi的双价表达载体pCAMBIA1300-Pi-ta+-Bchi,通过农杆菌介导法转入栽培稻品种云资粳41中,经过一定浓度的甘露糖筛选培养,分化得到的再生苗经氯酚红显色法和PCR检测,获得11棵转基因阳性植株,离体检测证明外源基因的导入增强了转基因水稻的稻瘟病抗性. 相似文献
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为了探究来源于水稻细条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)的hpa99基因改良小麦抗赤霉病的可行性,以小麦幼胚诱导的愈伤组织为转化受体,以磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase,PMI)作为选择标记,通过基因枪法将带有hpa99基因的表达质粒AF234296导入普通小麦品种山农15。2～3次PMI筛选后,获得38株再生植株。通过氯酚红(chlorophenol red,CPR)染色以及PMI基因和目的基因hpa99的PCR检测,获得7株阳性植株,转化率为0.108%。结果表明,hpa99已整合到小麦基因组中,获得了无抗生素标记基因的转基因小麦。 相似文献
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植物基因工程可有效地改良农作物的品质、性状或产量,尤其是对水稻这样重要的粮食作物,进行该方面的研究意义重大。在遗传转化过程中,抗性标记基因是筛选转化体的有效手段,但也带来了生态环境及食品安全方面的潜在隐患。为培育无选择标记转基因水稻,可采用共转化无选择标记系统,此方法简单易行,可操作性强,尤其是农杆菌介导的共转化法,应用较为广泛。同时,对获得的转基因水稻,其生物安全性也是人们普遍关注的重大问题。本文对近几年应用农杆菌介导的共转化系统培育无选择标记转基因水稻的研究进展及优化方法进行了综述,结合转基因材料安全评价标准,对转基因植物的推广及应用前景进行了展望。 相似文献
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为筛选标记基因用于植物遗传转化,采用组织培养、营养液筛选和叶面喷施等手段,综合评价了具有高催化活性的亚磷酸脱氢酶基因ptxDQ作为筛选标记基因用于水稻遗传转化的潜力.结果显示,ptxDQ基因作为筛选标记基因时,抗性愈伤的筛选效率为44.37％～47.28％,显著高于潮霉素和草胺磷等抗性基因的筛选效率.获得的转基因阳性幼... 相似文献
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MdSPDS1基因导入毛白杨的遗传转化体系优化研究 总被引：1，自引：1，他引：0
为了建立农杆菌介导的高效毛白杨遗传转化体系,并大量获得转MdSPDS1基因的转基因毛白杨,对MdSPDS1基因导入毛白杨的遗传转化体系中关键转化因子进行了优化。获得的优化转化体系如下:叶片预培养3d后,用OD600为0.4的菌液侵染7min,再共培养3d。卡那霉素抗性芽的二次筛选中,卡那霉素的选择压分别为20和50mg/L。实验获得毛白杨卡那霉素抗性植株共43株,经PCR检测,其中9株呈阳性,占抗性植株总数的20.9%,优化转化系统的阳性植株转化率达到9.38%。本研究为下一步鉴定基因功能和转基因植株耐盐性的分析奠定了基础。 相似文献
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[目的]进一步研究MNB1基因在植物应对镉胁迫响应中的功能,构建拟南芥中MNB1基因过量表达载体,通过筛选鉴定最终获得相应的转基因植株。[方法]以野生型拟南芥c DNA为模板,PCR扩增MNB1基因全长,将该基因连接到过量表达载体上;然后将构建成功的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101,浸花法转化野生型植株;最后利用转基因筛选与遗传鉴定获得MNB1转基因阳性植株。[结果]MNB1基因CDS全长1 368 bp,酶切连接后转化大肠杆菌鉴定得到阳性菌落,测序结果经比对完全正确。通过抗性筛选及PCR电泳检测获得阳性转基因植株。[结论]MNB1基因过表达载体构建成功并获得相应转基因植株,为进一步研究该基因调控植物镉胁迫响应中的功能及其分子机制奠定基础。 相似文献
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在植物基因转移过程中,标记基因常被用于筛选转化细胞或组织,给转基因工作带来很大方便.但在获得转基因植物之后,筛选标记基因的表达往往对环境及植物体的生长发育产生不良影响,且不利于使用相同标记基因进行多重转化.因此,使转基因植物释放后不带选择标记基因,对从事转基因的工作人员及消费者来说都是极为重要的.本文在对几种去除标记基因的方法进行总结的基础上,对该技术未来的发展趋势进行了展望. 相似文献
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[目的]进一步验证MYB4基因在响应干旱胁迫中的应答功能,构建ProMYB4:GUS载体,通过筛选鉴定获得相应的转基因植株。[方法]以野生型拟南芥植株的全基因组为模板,利用特异性引物扩增MYB4基因启动子,将目的基因连接到pART27载体上。然后将构建成功的重组载体转化至农杆菌GV3101,浸花法转化野生型植株。最后通过抗性筛选和PCR鉴定获得阳性转基因植株。[结果]MYB4启动子成功克隆,测序结果经过比对完全正确。抗性筛选获得了阳性转基因植株。[结论]成功获得ProMYB4:GUS阳性转基因植株,为进一步研究MYB4基因功能奠定了基础。 相似文献
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[目的]进一步研究LWT1基因在调控低温和干旱应答中的功能,构建拟南芥LWT1基因过表达载体,获得相应的转基因株系.[方法]以野生型拟南芥的cDNA为模板,利用PCR扩增LWT1基因全长,将该基因连接到pART27载体上.将获得的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101,通过浸花转化法将LWT1重组载体转化到拟南芥野生型植株中,利用转基因筛选与遗传鉴定获得LWT1转基因阳性植株.[结果]LWT1基因CDS全长990 bp,PCR电泳结果一致,测序比对结果正确.通过抗性筛选和分子鉴定获得转基因植株.[结论]LWT1过表达载体构建成功并获得相应的转基因株系,为进一步研究该基因的分子机制奠定基础. 相似文献
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转基因植物的筛选与检测 总被引：20，自引：0，他引：20
近年来,转基因的研究进展很快,对转基因植株进行筛选检测是基因转移的必须环节。本文综述了转基因中选择试剂的种类和应用范围;转基因植株的检测方法。Ｋａｎ抗性基因、Ｇｕｓ基因、Ｂａｒ基因是可安全使用的选择标记基因,其它选择基因的安全性尚待进一步评价。Ｇｕｓ基因可检测外源基因的表达部位,可作为首选的报告基因。ＰＣＲ是早期检测的较好方法。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交特异性强,可以研究外源基因的整和状态、位置数及外源基因的完整性和稳定性,因而应用最多。Ｗｅｓｔｅｒｍ杂交结果与性状表现有直接关系。 相似文献