共查询到15条相似文献，搜索用时 171 毫秒
1.
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)N-酰基高丝氨酸内酯酶基因(auto inducer inactivation A,aiiA)编码的N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acylhomoserine lactonase,AiiA)能够水解植物病原菌群体效应的信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone,AHL),进而使革兰氏阴性细菌群体感应受到抑制,减弱病原菌的致病性。本研究将aiiA基因连接至分泌型穿梭表达载体pPICZαB,获得重组表达质粒p PICZαB-aiiA,线性化后电击转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,获得重组工程菌GS115-p PICZαBaiiA。利用定点突变技术,对aiiA基因进行密码子优化,获得重组工程菌GS115-p PICZαB-MaiiA。以终浓度为1%的甲醇、28℃条件下诱导表达,重组工程菌GS115-p PICZαB-aiiA和GS115-p PICZαB-MaiiA均成功表达并分泌出AiiA蛋白。抗病性分析表明,分泌表达的AiiA蛋白能有效抑制胡萝卜软腐欧文氏杆菌(Erwinia carotovora)的致病性。AiiA蛋白在毕赤酵母中的分泌表达,拓宽了AiiA蛋白的获取途径,为AiiA蛋白的产业化提供理论依据。密码子优化为今后改造AiiA蛋白,提高AiiA蛋白的表达效率提供了新的思路。 相似文献
2.
里氏木霉RUT-C30内切β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达 总被引：1，自引：0，他引：1
摘要：以里氏木霉（Trichoderma reesei）RNA为模板，采用RT-PCR扩增的方法获得不带自身信号肽man1基因的cDNA片段。构建了重组表达载体pPIC9K-man1，重组质粒SacⅠ线性化后用PEG（聚乙二醇）法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中，通过PCR和表型鉴定表明man1基因已经整合到毕赤酵母染色体上。经大量筛选，获得高效分泌表达甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株RMAN23。将此菌株在5L发酵罐中进行高密度发酵，测定酶活最高达470IU /mL，同时对重组甘露聚糖酶的性质进行了初步研究。 相似文献
3.
根据毕赤酵母(Pichia pastons)密码子的偏好性,以氨基酸序列不变为原则,对源于蜡样芽胞杆菌(Bacillus cernes)M22的Mn-SOD基因进行分子改造,设计、合成了新的基因序列Mn-SOD-2.构建酵母表达载体pPICZαA/Mn-SOD-2,并整合至毕赤酵母GS115染色体.结果表明,所构建的重组体经0.5%甲醇诱导表达后,Native-PAGE检测证实有清晰单一活性条带;SDS-PAGE检测证实重组蛋白的分子量24 kD.酶活分析表明,外源蛋白的活性较改造前增加了2.2倍,且表达稳定性良好. 相似文献
4.
根据毕赤酵母（Pichia pastoris）的密码子偏好性,以不改变氨基酸序列为原则,对源于蜡样芽孢杆菌M22（Bacillus cerues M22）的Mn-SOD基因进行分子改造,设计、合成新的基因序列Mn-SOD-2。构建酵母表达载体pPICZαA/Mn-SOD-2,并整合至毕赤酵母GS115染色体。结果表明,所构建的酵母工程菌株YM103,经0.5%甲醇诱导表达后,Native-PAGE检测证实有清晰活性条带;SDS-PAGE检测证实重组蛋白的分子量为24kD,与预期大小一致。酶活分析表明,外源蛋白的活性较改造前增加了2.2倍,且表达稳定性良好。 相似文献
5.
木霉的纤维素酶系中通常缺少β-葡萄糖苷酶,导致了终产物抑制,木霉生长速度明显没有青霉快,因此,来源于青霉的纤维素酶受到了越来越多的重视.通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术从草酸青霉(Penicillium oxalicum)M菌株中克隆得到外切葡聚糖酶基因cbh1(GenBank登录号:HQ843504).该基因全长为1 641 bp,无内含子序列,编码547个氨基酸,具有Glu236,Asp238和Glu241典型催化残基,推测属于糖基水解酶第7家族.将cbh1克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建重组表达质粒pPIC9-cbh1,电击转入毕赤酵母(Pichia pastoris )GS 115菌株.阳性重组子经测序及活性分析表明,cbh1基因成功分泌表达,表明来源于草酸青霉的外切葡聚糖酶基因首次在毕赤酵母中获得成功表达.重组酶活性分析表明,其活性可达56IU/mg,最适反应pH、温度分别为6.0和55℃,且pH和温度稳定性均较好.研究结果认为,cbh1基因的克隆丰富了纤维素酶的基因资源,其在毕赤酵母中的成功表达也为该类纤维素酶基因高效工程菌株的构建提供了基础. 相似文献
6.
拟南芥Alpha-dioxygenase2(AtDOX2)在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为了获得具有生物活性的拟南芥(Arabidopsis thaliana)alpha-dioxygenase2(AtDOX2),将其对应基因AtDOX2编码区克隆到酵母表达载体pPIC9k中,获得重组表达载体pPIC9k-AtDOX2,将线性化的重组载体电击转化入毕赤酵母(Pichia pastoris)表达菌株GS115,经G418筛选、PCR鉴定和甲醇诱导时间优化,获得重组AtDOX2的高效表达菌株GS115/pPIC9k-AtDOX2。SDS-PAGE分析结果显示,0.5%甲醇诱导96h重组蛋白表达量最高,其表达量占胞外总蛋白的15%。重组AtDOX2的表观分子量约为70kD,经Ni-NTA柱亲和层析可获得纯度大于80%的重组蛋白。2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)法测定结果表明重组蛋白具有过氧化物酶活性,且其活性受Ca2+和Mg2+激活,受EDTA、咪唑和Mn2+抑制;2,4-二硝基苯肼(2,4-DNP)法测定结果显示,重组AtDOX2具有双加氧酶活性,Ca2+对其双加氧酶活性也有激活作用。结果说明利用酵母表达系统获得... 相似文献
7.
以嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var. levisporus)总RNA为模板，通过RT-PCR克隆出外切纤维二糖水解酶基因cbh1片段，采用RACE方法获得全长cDNA克隆，其全长为1 710 bp，编码一种由457个氨基酸组成的单肽，推导的氨基酸序列中1～19位为信号肽序列，GenBank的登录号为AY840982。将该片段克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达重组质粒pPIC9K/cbh1，转化毕赤酵母GS115，所得重组子经PCR验证后进行诱导表达，筛选出一重组子GSp-15,经144 h诱导后，外切纤维二糖水解酶表达量为1.17 mg/mL，产酶活力为20.3 U/mL。 相似文献
8.
草鱼leptin基因的分离鉴定及在巴斯德毕赤酵母中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
利用RT-PCR技术扩增出草鱼(Ctenopharyngodonidellus)的leptin基因,将leptin基因克隆至真核表达载体pPIC9K,电穿孔转化GS115菌株,经G418筛选和甲醇诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE琼脂糖凝胶电泳和Westernblot分析。结果表明,草鱼leptin基因cDNA序列由438个核苷酸组成,编码146个氨基酸组成的多肽(GenBank登陆号AY551335),与鲤鱼(Cyprinuscarpio)leptin基因相比,核苷酸和氨基酸的同源性为99%;与人、猪和鼠相比,核苷酸同源性分别为84%、86%和95%,氯基酸的同源性分别为84%、82%和96%;与河豚(Takifugurubripes)相比,氨基酸具有较大的差异,仅有9%的同源性,表明leptin在物种的进化上具有一定的差异;实现了草鱼leptin基因在毕赤酵母(Pichiapastoris)中的表达,表达蛋白的分子量约为16kD,Westernblot分析表明,表达产物具有一定的免疫学活性。 相似文献
9.
采用酵母偏爱密码子合成五条编码猪IGF-I基因的引物，利用重叠PCR技术拼接获得长度为210bp的猪IGF-I成熟蛋白基因。将该基因插入分泌表达载体pPIC9K中，转化巴斯德毕赤酵母菌。经表型鉴定、PCR分析及G418筛选得到Muts型多拷贝整合菌，以1.5%甲醇诱导培养后，经SDS-PAGE检测表达产物，在7.5 kDa处出现一特异蛋白条带，目的蛋白表达量达410mg/L。Dot blot检测表明，重组蛋白可与抗IGF-I多克隆抗体反应。 相似文献
10.
弹性蛋白酶基因(PAE)的克隆及在毕赤酵母中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
以1株产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)基因组DNA为模板,经PCR扩增得到的铜绿假单胞菌弹性蛋白酶(P.acruginosa elastase,PAE)基因,与GenBank中的序列对比发现同源性为99%.成功地构建了重组表达载体pPIC3.5K/PAE,莺组质粒Sac Ⅰ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株KM71中,通过PCR和表型鉴定表明,PAE基因已经整合到毕赤酵母染色体上.经大量筛选获得48株含高拷贝的重组毕赤酵母转化子.在甲醇诱导下,经过毕赤酵母高密度发酵进行PAE的表达,经SDS-PAGE分析.结果表明,在培养基上清中含有一明显特异性蛋白条带,大小为34kD.活性检测结果,酶活为1 060 U/mL,是出发菌株的26倍. 相似文献
11.
益母草抗菌蛋白LJAMP2的表达及抗菌活性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
LJAMP2是一种分离自益母草(Leonurus japonicus Houtt.)种子的非专一性脂转移蛋白类抗菌蛋白.将编码成熟的LJAMP2蛋白的基冈(GenBank Accession No.AY971513)插入到巴斯德毕赤酵母(Pichia pas-toris)表达载体pPIC9K中;重组质粒pPIC9K-LJAMP2经线性化后,用电转化法导入毕赤酵母菌株GS115(his-/mut+)中.转化子用含1.75 mg/mL G418的YPD平板筛选获得多拷贝Mut+转化子.将1%甲醇诱导LJAMP2表达后的发酵液,经进一步浓缩、凝胶过滤脱盐、CM FF阳离子交换色谱和反相HPLC进行纯化,获得纯度90%以上的LJAMP2菌株诱导24 h即有LJAMP2的表达,诱导168 h表达量达到最高;表达的LJAMP2蛋白对黑曲霉(Aspergillus niger)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、镰刀菌(Fusarium graminearum)真菌表现出抑制活性. 相似文献
12.
抗菌肽(antibacterial peptides)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的多肽,是天然免疫的重要组成部分.为了提高抗菌肽的表达量以及很方便地检测抗菌肽的表达情况,本研究利用口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV) 2A将荧光蛋白dTomato基因和3个串联的MagaininⅡ基因融合到一个开放阅读框中(open reading frame,ORE),融合的基因被置于pPIC9K载体醇氧化酶基因(AOX1)启动子的下游,构建分泌型重组酵母表达载体pPIC9K-dTomato -2A-3M,将线性化的重组酵母表达载体通过电击法转入毕赤酵母(Pichia pastoris )GS115中,经G418筛选和PCR鉴定得到阳性转化子,然后将其转至摇瓶,在30℃、0.5％甲醇的条件下进行诱导表达,连续诱导3d.SDS-PAGE电泳图谱显示,在31 kD(dTomato)和9.5kD(3M)处有蛋白条带出现,在荧光显微镜下观察酵母表达上清发出红色荧光,对大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑菌试验结果表明,重组抗菌肽串联的MagaininⅡ具有明显的抑菌效果.结果表明,由2A连接的融合基因(荧光蛋白dTomato和串联的MagaininⅡ)在毕赤酵母中成功的进行了表达,FMDV 2A在其C端剪切多聚蛋白,得到dTomato和串联的MagaininⅡ两个独立而有活性的蛋白,为小分子抗菌肽的表达提供一个高效的检测方法. 相似文献
13.
疏绵状嗜热丝孢菌糖化酶基因（gla）的克隆及在毕赤酵母中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
本研究以疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces laltltginosus)cDNA为模板,克隆了糖化酶基因(gla),序列分析表明gla的开放阅读框由1854个核苷酸组成,编码617个氨基酸.根据氨基酸序列推算该酶的分子量为64 kD,属于糖苷水解酶第15家族,具有该家族催化保守区的典型特征.PCR扩增gla的成熟蛋白编码基因,构建表达载体,经线性化后电击转化导入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris GS115),并成功进行了表达.重组酶经摇瓶发酵后酶活可达11.6 U/mL,经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换等步骤纯化了该重组蛋白,SDS-PAGE显示该重组蛋白大小约为67kD,比推测的蛋白分子量稍大,可能与该蛋白的糖基化有关.该重组酶的最适反应温度和最适pH值分别为60℃和5.0,该酶具有较高的热稳定性,70℃保温20 min后剩余酶活为54%. 相似文献
14.
豇豆胰蛋白酶抑制剂和硫氧还蛋白的融合表达和活性测定 总被引：2，自引：0，他引：2
采用融合蛋白表达技术，通过1个人工设计合成的柔性接头，将豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor,CpTI)基因与表达载体上的硫氧还蛋白(thioredoxin )基因连接，构建了融合表达载体。将表达载体转入大肠杆菌(Escherichia coli )GI724，通过色氨酸诱导获得高效表达，产物以可溶状态存在。活性测定显示，融合蛋白具有抑制胰蛋白酶的生物学活性。以大豆胰蛋白酶抑制剂为参照，将融合蛋白热处理后进行活性测定，发现它具有较好的热稳定性。将肠激酶(enterokinase)与融合蛋白在37 ℃作用16 h，可获得切掉thioredoxin的CpTI蛋白。活性测定显示，切除thioredoxin后CpTI的胰蛋白酶抑制活性比同样处理条件下的thioredoxin-CpTI明显下降，比活力仅为原来的80%，说明融合蛋白具有更高的稳定性。研究结果为thioredoxin-CpTI作为一种生物农药的应用奠定了基础。 相似文献
15.
在α-螺旋抗菌肽序列比较和两亲性分析的基础上,提取序列模板,计算机辅助（螺旋轮法）设计出新型抗菌肽模式肽PGYa(Peptide以Gly开头,以Tyr-NH2结尾),然后选用毕赤酵母偏爱密码子,设计合成了PGYa基因（rPCR法）。所合成的基因全长为94bp,并在其N端引入kex2裂解位点,以保证表达抗菌肽具有天然N端。基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型酵母表达载体pPICZα-A-PGYa。在AOX1 (醇氧化酶)启动子调控下,PGYa蛋白获得分泌表达,其表达量达到132 mg/L。初步抑菌（E.coli DH5α）活性显示：PGYa有较好的抗菌活性。 相似文献