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1.
《渔业科学进展》2017,(3)
本研究分析了CD59基因在牙鲆(Paralichthys olivaceus)感染鳗弧菌(Vibrio anguillarum)前后的表达模式。结果显示,感染前,CD59基因在检测的4种免疫器官中均不表达;感染后,该基因均有不同程度的表达,其中,肾脏的表达量最高。对牙鲆CD59基因进行原核表达,构建原核表达载体pET-32a-CD59,并将其转化入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得约为29 kDa的重组蛋白pET-32a-CD59。该蛋白以包涵体形式存在,通过His亲和层析柱纯化和超滤管浓缩目的蛋白后,经SDS-PAGE检测得到单一条带,纯化效果较好。Western blotting分析结果显示,重组蛋白p ET-32a-CD59可以与抗His单克隆抗体发生特异性反应,说明牙鲆CD59基因在大肠杆菌系统中成功表达。对重组蛋白进行透析复性,复性结束后,蛋白无析出或絮状沉淀,初步表明复性成功。选取嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、鳗弧菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌4种致病指示菌,测定复性重组蛋白p ET-32a-CD59的抑菌活性。研究表明,重组蛋白pET-32a-CD59对嗜水气单胞菌具有一定的抑菌活性。本研究旨在探究牙鲆免疫调节机制,并为提高牙鲆养殖效率提供一定的分子理论基础。 相似文献
2.
黄芩对7种水产动物病原菌的体外抑菌活性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
采用纸片扩散法和二倍稀释法,利用黄芩水提液对副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、温和气单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌进行最低抑菌质量浓度和最低杀菌浓度的测定。试验结果表明,黄芩对鳗弧菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑菌效果,最低抑菌质量浓度均为15.63 mg/ml,最低杀菌质量浓度分别为31.25、15.63、31.25、31.25 mg/ml;黄芩对大肠杆菌、温和气单胞菌和哈维氏弧菌的抑菌效果弱于副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、金黄色葡萄球菌,最低抑菌质量浓度分别为31.25、62.51、31.25 mg/ml,最低杀菌质量浓度分别为62.5、62.5、125 mg/ml。 相似文献
3.
巨噬细胞炎症蛋白-3α是一种可诱导的分泌蛋白,通过相应受体对多种免疫细胞产生趋化,在多种疾病的免疫反应和炎症损伤中发挥重要作用.实验采用RT-PCR技术克隆出黄喉拟水龟巨噬细胞炎症蛋白-3α(MaCCL20)的成熟肽基因序列,通过双酶切将目的基因序列插入到表达载体pET-32a上,然后转化进大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后表达出了pET-32a-CCL20融合蛋白,以该融合蛋白为抗原制备多克隆抗体并进行Western-blotting鉴定及抑菌性检测.实验表明,融合蛋白在37℃、0.8 mmol/L IPTG,4h条件下得到高效表达;经SDSPAGE凝胶电泳和Western-blotting分析显示,所表达融合蛋白相对分子量为30 ku,与预测蛋白大小一致并与带His标签的多克隆抗体发生特异性反应.经His Bind镍柱纯化后SDSPAGE电泳检测出现单一条带,说明获得了纯度较高的MaCCL20重组蛋白.抑菌实验表明,MaCCL20重组蛋白对金黄色葡萄球菌、粘质沙雷氏菌和嗜水气单胞菌都有较强的抑菌作用. 相似文献
5.
采用PCR方法对所克隆的斑节对虾溶菌酶基因的cDNA进行改造，并克隆至含温控启动子PRPL的大肠杆菌表达质粒pBV220，构建斑节对虾溶菌酶表达载体pBV220-lyz。该质粒转化大肠杆菌后经42℃诱导表达。SDS-PAGE电泳表明，表达产物中有16kD左右的特异性条带，与预期斑节对虾溶菌酶分子量相符。薄层扫描显示，重组斑节对虾溶菌酶约占全菌总蛋白的32％，纯化后的重组斑节对虾溶菌酶占全菌可溶性蛋白的90％左右。比浊法检测复性后产物的生物活性，结果表明重组斑节对虾溶菌酶的最适pH为6．0，最适温度为40℃。测定了重组斑节对虾溶菌酶对溶壁微球菌和几种鱼病原菌菌株的溶菌活力，结果表明，重组斑节对虾溶菌酶对溶壁微球菌、溶藻弧菌和鳗弧菌有较强的溶菌活力，对爱德华氏菌有一定的溶菌活力，对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和大肠杆菌DHSa溶菌活力较弱。 相似文献
6.
通过水生动物源性嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,Ah）强毒株J-1株与弱毒株MR-1株抑制差减杂交得到gneJ差减片段,该片段与创伤弧菌（Vibrio vulnificus）和人源嗜水气单胞菌的UDP-乙酰葡萄糖胺-4差向异构酶基因有较高的同源性。扩增完整的gneJ基因,进行分布检测并将其克隆至质粒pET32a（＋）,在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21中进行异源表达,SDS-PAGE结果显示,重组表达蛋白的分子量约59．7kD,与理论推测值基本相同。酶活性分析表明,该重组蛋白可将UDP-乙酰葡萄糖胺转化为UDP-乙酰半乳糖胺,确证gneJ基因编码蛋白为UDP-乙酰葡萄糖胺-4-差向异构酶。Western Blot分析显示,嗜水气单胞菌J-1株胞外产物的兔抗血清可识别该重组蛋白,表明该蛋白与天然蛋白有相同的抗原性。以重组蛋白为免疫原,对小鼠进行动物保护实验,结果显示,该重组蛋白对小鼠有60％的保护率,证明UDP-乙酰葡萄糖胺-4差向异构酶可作为亚单位疫苗的侯选成分。 相似文献
7.
应用PCR技术,从1株鳗源嗜水气单胞菌ML316中扩增得到β 溶血素基因AHL316HEM,将AHL316HEM克隆到pGEM TEasyVector,经分析验证后重组到pcDNA3.0中,构建了重组质粒PDLH。转化重组质粒PDLH的大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α能在血琼脂培养皿中形成明显的β 溶血斑,重组菌纯化的胞外产物溶血价为1.28×104HU·mg-1,同时重组菌的胞外产物能被原始菌株的高免血清特异性地识别。结果证实,克隆到鳗源嗜水气单胞菌β 溶血素基因,重组质粒PDLH能够表达具有天然生物学活性的β 溶血素,为构建嗜水气单胞菌核酸疫苗奠定了基础。 相似文献
8.
用95%的乙醇来提取地锦草(Euphorbia humifusa Wild)中的化合物,再分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水对地锦草乙醇提取物进行分极性段萃取,研究地锦草各极性段二甲基亚砜萃取溶液对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、柱状屈挠杆菌(Flexibacter calumnaris)、鳗弧菌(Vibrisis angnillarumz)4种常见水产动物病原菌的抑菌效果。结果表明,地锦草各极性段的抑菌作用强度有明显差别(P<0.05),其中乙酸乙酯、石油醚极性段的抑菌作用最为强烈,对温和气单胞菌的MIC均≥12.5mg/mL;乙酸乙酯极性段对嗜水气单胞菌、鳗弧菌的MIC均≥50mg/mL;石油醚极性段对嗜水气单胞菌、鳗弧菌的MIC≥25mg/mL;正丁醇和水极性段对4种菌的MIC均≥50mg/mL。 相似文献
9.
通过RT-PCR扩增三疣梭子蟹C-型凝集素（C-type lectin like-domain protein,CTLD）基因序列,将目的基因克隆入质粒pET32a,构建原核表达重组质粒pET32a-CTLD.将重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,通过IPTG诱导CTLD的表达,对其表达产物进行SDS-PAGE和Western blot 检测.用His GraviTrap Ni亲和层析柱及超滤离心管纯化目的蛋白,并对其进行活性检验.结果表明,构建得到CTLD基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;诱导表达出相对分子质量（M） 39 600的目的蛋白,经SDS-PAGE和Western blot检测,融合蛋白成功表达;重组C-型凝集素对兔的红细胞没有明显的凝集作用,但对小鼠红细胞的凝集效价是22,而对所选5种细菌的凝集作用存在差异,其中对大肠杆菌具有明显的凝集作用,而对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和金黄色葡萄球菌均无凝集现象.本研究结果为进一步研究C-型凝集素在免疫防御中的作用与地位提供依据. 相似文献
10.
《中国渔业质量与标准》2017,(4)
研究替米考星对3种水产致病菌体外抗菌作用,替米考星对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophilia)感染异育银鲫的防治效果和替米考星对异育银鲫的急性毒性作用。应用二倍稀释法研究质量浓度为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 mg/L的替米考星对嗜水气单胞菌(Aeromonas hyolrophila)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),并计算MBC/MIC比值。腹腔注射0.3 m L浓度为9×10~8CFU/m L的嗜水气单胞菌菌液感染体质量为(217.65±25.26)g的异育银鲫,分别在感染后1、24和48 h以0、50、100、150 mg/kg鱼体重的剂量分别口灌替米考星,计算替米考星对嗜水气单胞菌感染异育银鲫的保护率。应用剂量为0、260、300、340、387、440 mg/kg的替米考星口灌异育银鲫,记录异育银鲫的死亡率,计算替米考星对异育银鲫的半数致死量LD_(50)。结果表明,替米考星对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和鳗弧菌的MIC分别为4.00、0.50和1.00mg/L,MBC分别为64、32和32 mg/L,MBC/MIC比值分别为16、64和32;100和150 mg/kg鱼体重剂量的替米考星对嗜水气单胞菌人工感染异育银鲫的保护率可达100%;替米考星对异育银鲫口灌的24、48、72和96 h的半数致死剂量LD_(50)分别为344.0、306.3、298.5和298.5 mg/kg。替米考星对3种水产致病菌具有一定的体外抗菌效果;替米考星对嗜水气单胞菌感染的异育银鲫具有一定的保护作用;但同时替米考星对异育银鲫也具有中等毒性。本研究可为替米考星在水产养殖中的合理使用提供参考。 相似文献
11.
鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4基因的克隆、表达与免疫学检测方法 总被引：1，自引：0，他引：1
根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,Cy HV-2)ORF 4基因序列(Gen Bank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到ORF 4基因编码框全长序列1 041 bp,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-ORF 4。将p ET-32a-ORF 4重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到融合表达的重组蛋白,融合表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,其分子质量约为57 ku,与预期大小一致。将纯化的重组蛋白免疫日本大耳兔,制备了多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000,Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接免疫荧光检测结果表明:该多克隆抗体可与由Cy HV-2感染引起细胞病变的异育银鲫脑组织细胞(GICB)发生特异性的结合。 相似文献
12.
为评价罗非鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)BX2012株脂蛋白(lipoprotein)的免疫原性及其对奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)和大菱鲆(Scophthalmus maximus)的保护效果,以无乳链球菌脂蛋白基因序列(GenBank序列号:CP000114.1,SAK_0321)的B细胞线性抗原表位区设计特异性引物进行扩增,构建重组表达载体,将截短表达的脂蛋白制备成亚单位疫苗,同时制备灭活疫苗进行免疫比对。结果显示:重组表达载体p ET-32a-LIP342在BL21(DE3)中获得了良好的可溶性表达,分子质量约为30 kDa,纯化使LIP342纯度由41.75%提至87.23%;Western blotting分析显示,LIP342可被兔抗无乳链球菌高免血清特异性识别;LIP342在目前已知不同种属来源或不同血清型的无乳链球菌分离株中同源性为90.35%~100%,在罗非鱼源分离株中同源性为100%;无乳链球菌LIP342蛋白和灭活疫苗均可显著提升奥利亚罗非鱼和大菱鲆血清抗体水平,而LIP342诱导的血清抗体水平均显著高于灭活疫苗;经0.1 mL 1×10~9cfu/mL的无乳链球菌攻毒后,LIP342蛋白和灭活疫苗对供试鱼的累积存活率均显著高于PBS对照组。结果表明,高度保守的LIP342具有较好的免疫原性,可作为无乳链球菌亚单位疫苗候选因子。 相似文献
13.
LC3B是检测自噬程度的标志性分子,但是在低等动物体内缺少特异性强的LC3B抗体。为研究贝类的自噬性细胞死亡,本研究通过将紫贻贝的LC3B编码序列克隆到pET-32a原核表达载体中构建重组表达载体,进而对IPTG诱导浓度、诱导表达时间进行摸索;采用亲和层析对重组蛋白进行纯化,并采用SDS-PAGE检测及Western blot进行验证;利用获得的重组蛋白免疫新西兰兔,制备其多克隆抗体。结果显示,在20℃,转速为150 r/min条件下,当IPTG浓度为0.6 mmol/L,诱导表达10 h后,可以得到高表达量、可溶性的重组MgLC3B-His融合蛋白,亲和层析纯化后,获得单一条带的MgLC3B-His可溶性重组蛋白;采用纯化后的MgLC3B-His融合蛋白对新西兰兔进行多次免疫,采集分离兔抗血清并利用protein A纯化,获得紫贻贝的LC3B多克隆抗体,效价为25 600。紫贻贝LC3B多克隆抗体的成功制备,为今后深入开展紫贻贝及相近物种的细胞自噬研究奠定了基础。 相似文献
14.
采用重测序方法,利用牙鲆(Paralichthys olivaceus)野生个体,扩增了牙鲆丝氨酸蛋白酶(Serine protease) I-1基因的编码区(CDS)和2605 bp的启动子序列。在牙鲆丝氨酸蛋白酶I-1基因(PoSP I-1)编码区中筛选出9个单核苷酸多态性位点(SNPs),同时在其启动子区筛选出28个SNP位点。对感染鳗弧菌的抗病牙鲆和易感牙鲆进行了部分SNP位点的分型,通过分析CDS中SNP位点的分布情况,发现SNP365A/G位点在抗病个体中的AG基因型的基因频率是60%,高于易感个体的40% (P=0.01)。qRT-PCR结果显示,易感个体在细菌感染后,PoSP I-1相对表达量相比对照组呈下降趋势。在抗病个体中,PoSP I-1相对表达量相比对照组呈上升趋势,且高于易感个体。结果表明,丝氨酸蛋白酶基因在牙鲆抗鳗弧菌感染中发挥重要作用,该基因的SNP365A/G位点是与牙鲆鳗弧菌感染相关的候选位点,该位点可作为牙鲆抗鳗弧菌选择育种的潜在标记。 相似文献
15.
在基础饲料中分别添加维生素E(VE)(60mg/kg标为e或300mg/kg标为E)和硒(Se)(0mg/kg标为s或2.5mg/kg标为S),制成4种试验饲料(s/e,s/E,S/e,S/E)分别饲喂初始体重为38.5±0.15g的牙鲆70d,观察其对生长性能、肝脏及血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、非特异免疫力以及抗病力的影响。结果表明,饲喂添加高剂量VE的两组饲料(s/E,S/E),牙鲆的特定生长率和吞噬率明显地提高(P0.05)。饲喂添加硒的两组饲料(S/e,S/E),牙鲆血液和肝脏的GSH-Px活性显著升高(P0.05)。70d投喂实验结束后,利用鳗弧菌进行攻毒试验,不添加硒和低剂量VE(s/e)使牙鲆的累积死亡率明显高于其他3组。 相似文献
16.
牙鲆抗鳗弧菌病AFLP分子标记筛选 总被引：13，自引：1，他引：12
牙鲆(Paralichthys olivaceus)感病群体和抗病群体通过注射鳗弧菌(Vibrio anguillarum)获得。利用61对AFLP引物组合扫描了牙鲆感病群体和抗病群体各20个个体,结果共扩增出3 200条带,8条AFLP带在2个群体中显示了极大的差异(P<0.01),其中有2条带是在抗病群体中出现的高显性基因频率的标记,另外6条带是在感病群体中出现的高显性基因频率的标记。这些标记很可能是与抗病性相关的候选标记。这些抗病性候选标记的获得为实现牙鲆分子标记辅助育种和抗病基因克隆奠定了一定基础。[中国水产科学,2007,14(1):155-159] 相似文献
17.
通过对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)进行全基因组及转录组测序,预测了一个半滑舌鳎性别相关基因CSFR2,目前已对该基因进行了克隆和表达分析。为进一步研究CSFR2基因的功能,本研究从蛋白层面入手,构建了原核表达载体p ET-32a-CSFR2,转化到大肠杆菌E.coli进行诱导表达,用His Trap进行蛋白纯化,SDS-PAGE电泳检测诱导及纯化产物,并将表达纯化的CSFR2蛋白注射1龄半滑舌鳎精巢。由于CSFR2是一个性别相关基因,因此无法通过免疫反应来直接检测其蛋白活性,本研究通过不同时间点取样检测半滑舌鳎其他性别相关基因Cyp19a和Foxl2的表达量变化,来间接反应CSFR2蛋白的活性及功能。实验结果显示,重组蛋白能够进入到活体细胞内并发挥一定作用,在6–72 h内对性别相关基因Cyp19a和Foxl2的表达有上调作用,说明CSFR2蛋白具有生物活性,并能调节其他性别相关基因的表达量,间接促进雄激素转化为雌激素。本研究进一步了解CSFR2基因在半滑舌鳎性别决定与分化中的作用,可为半滑舌鳎性别控制提供理论依据,在人工诱导鱼类性逆转方面有重要应用价值。此外,本研究为蛋白活性验证提供了一种新方法。 相似文献
18.
褐牙鲆腹水症病原菌的分离鉴定及其灭活疫苗的研制 总被引：2，自引：0，他引：2
从患腹水病褐牙鲆体内分离致病菌,通过生理生化和分子生物学方法进行鉴定;该菌的16S rDNA序列与标准株同源性达99.8%,证明该菌为嗜水气单胞菌.制备灭活疫苗后分别注射小鼠和牙鲆,测定其免疫效果.试验结果表明,用所制备的灭活疫苗免疫小鼠,其保护率达到90%,免疫牙鲆的保护率达到80%;采用渗透压差法浸泡免疫牙鲆在攻毒后发病率仅为6%,攻毒后保护率为85%;通过间接ELISA检测表明受免动物体内产生了较高水平的抗体;剖检及病理切片结果表明免疫过的动物内脏健康无异样,而未免动物肝脏充血,肠腔有积水.说明该疫苗安全有效. 相似文献
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选用硝酸纤维素膜作固相载体,建立检测迟钝爱德华氏菌的斑点酶联免疫吸附试验诊断方法。根据棋盘试验,确定迟钝爱德华氏菌免疫血清最佳工作浓度为1∶800,酶标抗体最佳工作浓度为1∶200,以出现明显清晰斑点者判定为阳性。用该方法检测时,迟钝爱德华氏菌呈阳性,温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、河流弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、腐败希瓦氏菌、产碱普罗威斯登菌、阪崎肠杆菌和大肠杆菌均呈阴性。试验结果表明,Dot-ELISA方法简便、特异、快速、结果直观,便于在基层推广使用。 相似文献