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BmNPV多角体蛋白片段引导外源蛋白固定入多角体的研究 总被引：1，自引：1，他引：0
家蚕核型多角体病毒(BmNPV)晚期产生大量多角体,其主要作用是包埋病毒粒子免受外部恶劣环境的影响,为次代感染提供保障。将BmNPV多角体基因分段克隆并与报告基因——增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合,利用BmNPVPolh+Bac-to-Bac表达系统构建重组病毒,使多角体蛋白与融合蛋白在BmN细胞内共表达。分析感染细胞和形成的多角体中融合蛋白的含量,研究不同的多角体蛋白片段引导EGFP固定入多角体的效果,结果表明构建的5种重组病毒都能大量表达融合蛋白,每种多角体蛋白片段都能引导EGFP固定入多角体内部,且外源融合蛋白在多角体总蛋白中占有较高的比例,其中,以多角体蛋白N末端100个氨基酸和完整多角体蛋白序列作为信号固定EGFP的效率最高。这一现象为解决活性蛋白长期保存提供了新思路,同时对于开发含有毒素蛋白的新型生物杀虫剂和新型疫苗的转运载体也具有较好的参考价值。 相似文献
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昆虫质型多角体病毒与杆状病毒多角体的结构比较 总被引：1，自引：0，他引：1
依据已有的研究结果,分析比较昆虫质型多角体病毒和杆状病毒多角体的结构差异。2种病毒都产生多角体,其中质型多角体病毒多角体的原子结构展现一个错综复杂的三聚体组装,即通过多角体蛋白分子突出的N-端螺旋臂互相连接在一起;杆状病毒和质型多角体病毒的多角体晶体相似,蛋白序列的N-末端也是α-螺旋。由此表明这2种病毒的多角体蛋白及其共同结构基础具有同源性。但一些研究表明质型多角体病毒和杆状病毒的多角体基础分子组织形成不同。尽管这2种病毒多角体含有相近的结构单位及共有对称方式,但是多角体分子在结构上差别较大,在晶体内的组装形式也不同,特别是二硫键和N-端区域的区域交叉使杆状病毒多角体的晶体构造稳定坚固,C-端臂使其结构单位相互连接在一起。有研究表明N-末端螺旋突出臂在杆状病毒和质型多角体病毒中也具有不同的结构功能,但目前并没有结构方面的证据证明这2种病毒多角体具有共同的进化起源。 相似文献
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家蚕核型多角体病毒四角形多角体的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
BmNPVt是从BmNPVh中筛选出的一株四角形多角体病毒突变株。研究表明:BmNPVt的潜伏期、致病力、寄生部位、细胞病变同BmNPVh无甚差异;BmNPVt和BmNPVh之间存在干扰现象;Bm-NPVt的增殖类似于BmNPVh,但囊膜的形成方式两者之间不同。四角形多角体表面粗糙,具有小孔;它的外层电子密度较高,有一厚度为1500A的中间层。多角体蛋白晶格间距离为48A,分子量为29000dolt。同六角形多角体蛋白相比,四角形多角体蛋白的Glu含量较低,Tyr含量相对较高,胰酶酶切图谱两多角体蛋白存在差异。此外,多角体蛋白中Cu、Fe的含量和对酸碱溶解性,两多角体间也存在差异。BmNPVt为杆状,大小为330—340×85nm,纯病毒具有典型的杆状病毒紫外吸收特性,BmNPVt—DNA的变性温度为83℃,分子量为6.94×10~7dolt。镇江株、苏州株、日本株之间病毒DNA的EcoRI酶切图谱存在差异。 相似文献
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杆状病毒(baculovirus)多角体蛋白(polyhedrin)是晚期高水平表达的蛋白质,对于维持病毒粒子在自然环境下的稳定性和在宿主之间的传播至关重要。PCR扩增家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)多角体蛋白基因polh,亚克隆到原核表达载体p ET32,获得重组质粒p ET32-polh,并转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)表达菌株进行原核表达,诱导表达的融合蛋白带His标签,经镍柱纯化后用于免疫新西兰大白兔,制备抗多角体蛋白的多克隆抗体。Western blot检测该多克隆抗体能够特异识别Bm NPV的多角体蛋白。利用该多克隆抗体进行免疫荧光和Western blot分析多角体蛋白的亚细胞定位及表达时相,结果显示多角体蛋白定位于细胞质,且在病毒感染后48 h才可以被检测到。该多克隆抗体可用于Bm NPV多角体蛋白的功能研究。 相似文献
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利用扫描电子显微镜观察了在家蚕幼虫体内传代三次后的家蚕质型多角体病毒的多用体形态，发现有部分畸形多角体，这种畸形多角体主要出现在四角形系列中。畸形多角体有二种类型：嵌合式和缺陷型，前者数量多于后者。 相似文献
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<正> 关于家蚕(Bombyx mori)核型多角体病毒(BmNPV)已是研究较为深入的一种杆状病毒。家蚕细胞系统是研究病毒与宿主相互关系,病毒的特异性,病毒基因表达的理想实验材料。最令人感兴趣的是:这一材料已发展成为表达外源基因的载体宿主系统。目前国内正积极利用该材料,从事各种研究。系统地研究BmNPV在离体细胞中的复制增殖,特别是在较大规模培养细胞水平探索病毒增殖规律方面,对于进一步开发应用这一病毒资源,拓宽其应用价值是十分重要的。本文在静止培养70毫升细胞规模下,研究了BmNPV的离体增殖及其特征。 相似文献
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利用BmNPV多角体包埋外源蛋白的观察 总被引：4，自引：4，他引：0
家蚕核型多角体病毒在感染晚期大量表达产生多角体蛋白,并形成结构致密的超大分子蛋白质晶体,以有效保护内部包埋的病毒粒子,保证子代病毒的传播。借鉴多角体包埋病毒粒子的原理,观察到多角体也能将外源蛋白质固定入多角体内部。利用能形成多角体的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建的含有绿色荧光蛋白(EGFP)的重组病毒能在表达、产生正常多角体的同时也表达EGFP蛋白。共聚焦分析表明,该重组病毒感染后形成的多角体能够发射绿色荧光。被包埋的EGFP蛋白放置1个月后仍能检测到绿色荧光,干燥处理30min后仍能检测到荧光。由此说明将多角体与外源基因同时表达,多角体中会包埋外源蛋白,且能较长时间保存外源蛋白的生物活性。这一现象为解决蛋白质长期保存提供了新思路,对于开发含有毒素蛋白的新型生物杀虫剂也有很好的参考意义。 相似文献
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家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)是一种具有较强传染性的病毒，在感染的极晚期超高水平表达一种约29 kD的碱溶性多角体蛋白。但该蛋白为病毒复制的非必需蛋白，因此，利用该基因可以被删除或被外源基因替换而不影响病毒的复制的原理构建重组病毒，可以实现外源基因的高水平表达。然而，目前虽已经有较多文献研究多角体蛋白高水平表达的分子机制，但迄今对于多角体蛋白基因编码区的结合蛋白尚不明确。本研究通过DNA pull-down联合质谱技术对结合在多角体蛋白编码区的蛋白质进行鉴定，共鉴定到78个宿主来源的蛋白和49个病毒自身编码的蛋白。对这些蛋白进行GO注释，结果表明这些蛋白除了具有共同的核酸结合功能外，还有其他不同的生物学功能，共同在多角体蛋白的超高水平表达过程中发挥作用。进一步从上述蛋白中筛选出了最值得深入研究的9个宿主蛋白和10个病毒蛋白。对这些蛋白进行深入研究，将为深入揭示多角体蛋白超高水平表达的分子机制提供新的线索。 相似文献
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柞蚕核型多角体病毒和家蚕核型多角体病毒的同义密码子使用模式分析 总被引：3，自引：3，他引：0
基因组中的基因和基因密码子组成不同使柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)与家蚕核型多角体病毒(BmNPV)间不能交叉感染。通过计算有效密码子数(ENc)、相对同义密码子使用度(RSCU)、GC含量、GC3s含量、密码子适应指数(CAI),比较分析ApNPV和BmNPV同义密码子使用模式差异。ApNPV和BmNPV的密码子偏好性均较弱,但二者的ENc值和GC含量差异显著;除碱基组成外,还存在其它因素影响密码子使用模式,但各影响因素的贡献率均较低,在基于密码子使用频率的对应分析中BmNPV的第1、第2向量轴贡献率均低于ApNPV;ApNPV的基因表达水平与GC含量、GC3s含量以及ENc值极显著相关(r分别为0.418、0.735、-0.628,P=0.000),而BmNPV的基因表达水平只与GC3s含量呈弱相关(r=0.214,P=0.010)。分析结果显示,ApNPV和BmNPV的密码子偏好性虽均较弱,但同义密码使用模式及其影响因素存在差异。 相似文献
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为了解家蚕质型多角体病毒(BmCPV)的多角体蛋白对异源蛋白的包埋作用,将BmCPV的多角体蛋白基因克隆至昆虫细胞表达载体pIZT/V5-His,转染家蚕卵巢培养细胞(BmN)后通过吉欧霉素(zeocin)筛选获得稳定表达多角体蛋白的细胞株。倒置荧光显微镜观察发现,转化BmN细胞有轻度的病理变化,细胞质中有呈绿色荧光的多角体蛋白结晶,但从转化BmN细胞中纯化的多角体无明显的绿色荧光。以修饰型线性化家蚕杆状病毒BmPAK6感染稳定转化BmN细胞,96 h后纯化多角体,回复感染显示多角体裂解液能感染家蚕BmN细胞,表明BmCPV多角体蛋白能包埋BmPAK6。纯化的多角体及多角体裂解液均能用X-gal显色,表明BmPAK6表达的β-半乳糖苷酶也能被BmCPV的多角体蛋白包埋。研究结果可为获得具有多角体的重组杆状病毒以及开发利用质型多角体蛋白包埋异源蛋白的功能提供新的技术途径。 相似文献
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家蚕质型多角体病毒(苏州株)S10片段的cDNA克隆及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为了探讨质型多角体病毒基因的遗传与变异,通过RT-PCR从家蚕(Bombyx mori)质型多角体病毒(Cytoplasmic Polyhedrosis Virus,CPV)苏州株(BmCPV-suzhou)的dsRNA中成功克隆了S10片段。该片段cDNA含有一个744bp的完整开放阅读框(ORF),编码由248个氨基酸残基组成的多角体蛋白,其分子量为28.46kD,等电点为7.12。比较不同宿主来源的CPV多角体蛋白基因氨基酸序列发现,同型CPV多角体蛋白基因高度相似,而不同型的CPV多角体蛋白之间几乎没有同源性;基于质型多角体蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列的系统进化分析表明,BmCPV的不同株系与舞毒蛾(Lymantria dispar)CPV(LdCPV)和马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus)CPV(DpCPV)聚为一类,表明三种CPV的亲缘关系较近。研究结果为深入探讨质型多角体病毒的变异与分子进化提供了新的参考。 相似文献
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为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的包涵体衍生病毒(ODV)囊膜蛋白在病毒粒子包涵入多角体过程中的作用,选择2个ODV囊膜蛋白ODV-E25和ODV-E56作为研究对象,利用能够表达多角体蛋白的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建了融合表达E25-EGFP和E56-EGFP的重组病毒,在家蚕卵巢培养细胞系(BmN)中进行表达和定位分析。结果表明2种融合蛋白均在BmN细胞中成功表达,并于荧光显微镜下观察到绿色荧光主要分布在细胞核中。从感染的BmN细胞中收集纯化多角体,观察到多角体也能激发出绿色荧光,用Western blot方法进一步证实多角体中含有融合蛋白。这一现象表明当囊膜蛋白基因与外源基因融合表达时,外源融合蛋白能够进入多角体内部,推测这2种ODV囊膜蛋白不仅在病毒粒子包涵入多角体的过程中起信号引导作用,并能引导外源目的蛋白进入多角体。 相似文献
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蓖麻蚕核型多角体病毒(Phcy NPV)是柞蚕核型多角体病毒(Anpe NPV)的变种,不能感染柞蚕。通过病毒基因组GC含量、GC3s含量、有效密码子数、相对同义密码子使用度、密码子偏好参数的计算及ENc-plot分析、中性绘图分析、对应分析等,比较Phcy NPV和Anpe NPV的密码子使用模式。Phcy NPV、Anpe NPV分别只有1个和4个ORF的密码子偏好性较强。与Anpe NPV比较,Phcy NPV少数ORF的GC含量、GC3s含量、有效密码子数量和密码子偏好参数变化较大,但2种病毒ORF组间的GC含量、GC3s含量、有效密码子数和密码子偏好参数均无统计学差异(P=0.135、P=0.189、P=0.192、P=0.200)。2种病毒ORF组间,由同义密码子编码的18种氨基酸的密码子使用均无统计学差异(P0.05),鉴定的17种偏好性密码子也均相同。GC碱基组成是影响2种病毒ORF组密码子使用模式的主要因素,而自然选择对GC碱基组成的影响大于突变压力,但2种病毒间自然选择的影响程度无统计学差异(P=0.770)。Phcy NPV在适应新宿主蓖麻蚕的进化过程中密码子使用模式变化较小,尚不能通过密码子使用模式分析解释杆状病毒在不同宿主间的交叉感染机制。 相似文献
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家蚕核型多角体病毒病是蚕业生产上最常见危害最为严重的一类蚕病,给蚕业生产带来巨大的经济损失。多年来,蚕业科研人员一直致力于筛选抗性家蚕品种资源、阐明抗性分子机制和发现抗性基因,并应用分子标记辅助育种、转基因RNA干涉技术等现代分子育种手段选育抗性新品种,本文对相关研究进展进行了综述。 相似文献