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1.
利用PCR方法扩增猪圆环病毒2型核定位信号区缺失的Cap蛋白基因,将其亚克隆入杆状病毒表面展示质粒pBACsurf-1的gp64信号肽和gp64成熟蛋白之间.将此融合片段亚克隆到质粒pcDNA3.1(+),获得重组质粒pcDNA3.1-gp64-dCap.然后将含有CMV启动子,gp64及dCap的基因片段克隆到杆状病... 相似文献
2.
以鸡传染性支气管炎病毒M41毒株基因序列为模板,利用PCR方法扩增膜定位信号缺失的S1基因(dS1),将其亚克隆入杆状病毒表面展示质粒pBACsurf-1中,再次将S1及gp64的基因片段克隆到杆状病毒转移质粒pFastBacTMDual,得到重组质粒pFastBac-gp64-dS1.将该重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中,获得重组穿梭载体Bacmid-gp64-dS1,提取重组Bacmid质粒,以PCR验证其正确性.将阳性重组Bacmid质粒利用脂质体转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-dS1.间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒可以Sf9昆虫细胞膜表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白. 相似文献
3.
【目的】真核表达 H7 亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）HA 蛋白,为进一步制备 H7 亚型 HIV 亚单位疫苗,评价其免疫原性提供基础。【方法】首先根据草地贪夜蛾卵巢细胞（Spodoptera frugiperda clone 9, Sf9）的密码子偏嗜性,优化并合成 H7 亚型 AIV 的 HA 序列,将其克隆至穿梭质粒 pFastBac1 中;接着将重组HA基因的杆状病毒质粒转染至 Sf9 中,通过间接免疫荧光和 Western blots 试验鉴定重组病毒是否拯救成功;再通过 SYBR green 染料法荧光定量 PCR 试验,建立基于 gp64 基因的杆状病毒 qPCR 定量方法,筛选出在 Sf9 中表达 HA 重组蛋白的最佳感染复数和孵育时间;最后通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白。【结果】表达 H7 亚型 AIV HA 蛋白的重组杆状病毒在 Sf9 盲传 3 代后,Sf9 开始出现肿胀、脱落、死亡等细胞病变,表明重组杆状病毒拯救成功;通过间接免疫荧光和 Western blots 试验发现,Sf9 内出现可与 HA 重组蛋白特异性结合的绿色荧光信号,特异性结合的 HA 重组蛋白条带大小约 70 kD 左右,与预期相符,且 HA 重组蛋白可与 H7 亚型 AIV 阳性血清反应,表明 HA 重组蛋白表达成功;以构建的 pUC19-gp64 质粒为标准,建立基于 gp64 基因的杆状病毒qPCR 检测方法,该方法在 1×103~1×108 copy/μL 间呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数 R2=0.993;利用qPCR 检测方法对杆状病毒液滴度进行定量,并通过 Western blots 试验筛选 HA 蛋白表达的最佳感染复数和孵育时间,结果显示以 10 MOI 的比例接种 Sf9,孵育 72 h,蛋白表达效果最好;通过 His 镍株亲和纯化 HA 重组蛋白,蛋白浓度为 0.268 mg/mL,鸡红细胞凝集效价为 4 log2。【结论】本试验在 Sf9 中成功表达并纯化 H7 亚型 AIV HA 蛋白,并建立与之相应的杆状病毒荧光定量 PCR 检测方法,可为进一步评价 H7 亚单位疫苗的免疫原性提供参考。 相似文献
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表达带His-tag的禽流感病毒HA基因杆状病毒转移载体的构建及重组病毒的鉴定 总被引：4，自引：0，他引：4
经RT-PCR扩增了禽流感病毒A／Goose／GuangDong／1／96（H5N1）1．7kb HA基因的eDNA将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后，亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis4．5，筛选到重组质粒命名为rpBacHisH5HA。测序正确后，在脂质体介导下，与线性化的杆状病毒ENA（Bac-N-Blue TMDNA）共转染Sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经3轮蚀斑纯化，获得数株重组杆状病毒rBacHisH5HA。提取重组病毒DNA经PCR证明目的基因片段已插入杆状病毒基因组。 相似文献
5.
采用异硫氰酸胍法提取禽流感病毒分离株的SPF鸡胚尿囊毒RNA,利用RT-PCR技术扩增出禽流感病毒HA基因的cDNA。将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后,亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis,筛选到重组质粒,测序正确后与线性化的杆状病毒DNA(Bac-NBlueTMDNA)共转染Sf9昆虫细胞,挑取蓝色蚀斑,经三轮蚀斑纯化,获得数株重组杆状病毒rpBlueBacHisH9HA。提取重组病毒DNA,经PCR证明目的基因片段已插入到杆状病毒基因组中,血凝实验、SDS-PAGE实验结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的Highfive细胞中获得了表达。 相似文献
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禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]研究禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达。[方法]将禽流感病毒H5N1亚型HA基因以BamHI和NotI双酶切插入pFastBacI载体构建pFast-H5HA转移载体质粒,然后将pFast-H5HA转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中发生转座作用,在含有X-gal、IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上筛选白色菌落,通过连续传代4次后获得稳定的重组质粒reBac-mid-H5HA。[结果]将重组质粒reBacmid-H5HA转染Sf9昆虫细胞,获得含有禽流感病毒H5N1亚型HA基因的重组杆状病毒,经间接免疫荧光和Western-blot证实HA基因在昆虫细胞中获得表达。重组杆状病毒表达产物能够凝集鸡红细胞,并能被抗H5N1 HA单抗所抑制。[结论]重组血凝素蛋白在杆状病毒中能获得正确表达,为研制AIVH5亚型检测抗原和亚单位疫苗奠定基础。 相似文献
7.
通过设计特异引物,扩增获得口蹄疫病毒3ABC编码区的目的基因片段,将其用SalI和NcoI双酶切后,与经同样处理的带有一段信号肽序列的穿梭质粒pMelBac-B连接,经筛选、鉴定及DNA序列分析后,获得重组质粒pMel-3ABC.将重组质粒与线性化的杆状病毒骨架Bac-N-Blue共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.用重组病毒感染Sf9昆虫细胞,通过间接ELISA方法,检测细胞培养基上清液中表达的口蹄疫病毒抗原.结果表明,口蹄疫病毒基因片段3ABC正确克隆到杆状病毒载体上,重组病毒可在昆虫细胞中表达目的蛋白. 相似文献
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表达H3N2亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒对小鼠免疫原性的研究 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】构建一株表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的复制缺陷型重组腺病毒,并测定其对小鼠的免疫效力。【方法】以含有SIV A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)HA基因的重组质粒pMD18-H3HA为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增HA基因,将其亚克隆入质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有H3HA及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP。利用脂质体转染方法将穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP基因在细胞中的表达筛选重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP。将重组病毒rAd-H3HA-EGFP以108TCID50两次接种6周龄的Balb/c小鼠,时间间隔为3周,通过检测免疫小鼠的抗体水平及对病毒攻击的保护情况评价该重组病毒的免疫原性。【结果】HA基因已被重组到腺病毒的基因组中,并能够伴随病毒的复制而表达,表达蛋白具有良好的生物性活性。重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP经增殖、纯化后其TCID50可达1.58×1010.mL-1,以108TCID50的剂量免疫小鼠后,能够诱导产生高水平的特异性抗体,并对H3亚型SIV的攻击提供有效保护。【结论】构建了一株具有良好免疫原性的复制缺陷型重组腺病毒,为H3亚型SI活载体疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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H5亚型AIV的HA1基因与鸡IL-18成熟蛋白基因的杆状病毒共表达载体的构建 总被引：1，自引：1，他引：0
参考GenBank上发表的H5亚型禽流感(AIV)血凝素(HA)基因序列及鸡白细胞介素18成熟蛋白(mChIL-18)的cDNA基因序列,分别设计了HA1和mChIL-18的cDNA的2对引物。然后以pMD18-T-HA质粒和pGEX-mChIL-18质粒为模板,扩增出了H5亚型AIV的HA1基因和mChIL-18的cDNA片段。再以杆状病毒pFastBacTM dual为载体,将H5亚型AIV HA中的HA1基因和mChIL-18基因分别插入到双表达载体pFastBacTM dual的p10启动子(PP10)和多角体蛋白启动子(PPH)的下游,构建携带HA1基因和mChIL-18基因的重组pFastBacTM dualH-A1-mChIL-18真核表达质粒。最后将构建的真核表达质粒转座入大肠杆菌DH10Bac,为下一步进行昆虫细胞的转染奠定了基础。这个重组载体的构建为考察mChIL-18作为免疫增强剂的作用及下一步AIV疫苗的研究奠定了坚实的基础。 相似文献