猪流行性腹泻病毒Real-time PCR检测方法的建立   总被引：2，自引：1，他引：1  

孟凡伟 张雪王俊  单晶晶王鹏周双海  王志军 《中国农学通报》2014,30(5):41-45

为定量检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）载量,建立PEDV的Real—timePCR方法。用RT-PCR方法扩增PEDV的M基因片段,构建含有M基因片段的重组质粒,用该重组质粒进行SYBRGreen I Real—timePCR,来建立检测PEDV的荧光定量PCR方法。结果显示：在（5．56×10^2-5．56×10^7）拷贝／皿范围内,所建立方法具有优良的线性关系,其决定系数为0．9996,扩增效率为99．5％,扩增产物的熔解曲线只有一个特异性峰,无引物二聚体峰,熔解温度为（81．18±0．21）℃。该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒II型等猪源病毒均检测不到扩增产物,重复性试验的变异系数小于3％,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明：建立的Real-timePCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏性高,可用于PEDV的定量检测及其早期感染的快速诊断。  相似文献   

鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR检测方法的建立     

程晓霞  王劭  朱小丽  陈仕龙  林锋强  陈少莺 《中国农学通报》2009,25(5):14-17

根据GenBank上发表的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）基因序列,针对IBV M基因全序列设计合成了一对引物, 以IBV疫苗株为模板, 建立了检测IBV的RT-PCR方法。应用该方法对IBV疫苗株RNA进行扩增, 获得与预期大小相符, 长度为1105bp的特异性目的片段;敏感性测定该RT-PCR可扩增到18pg的IBV-M-cDNA。结果表明建立的RT-PCR方法对IBV的检测敏感性高、特异性强,可用于IBV感染的诊断和流行病学调查。  相似文献   

鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR快速检测方法的建立   总被引：1，自引：1，他引：0  

刘金朋商艳红  陈红英王淑娟王子馨  王亚丹师丽刚 《中国农学通报》2011,27(3):342-346

根据鸡传染性支气管炎病毒(IBV) N基因序列（FJ767920）,利用引物软件Premier5.0,设计并合成了1对特异引物,通过对RT-PCR扩增条件的优化,建立了一种快速检测IBV的RT-PCR方法。应用该方法成功地从IBV M41和河南株HN99中扩增出318 bp的目的片段,而传染性喉气管炎病毒、新城疫病毒及马立克病毒基因组均未扩增为出相应的片段。将回收的RT-PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体后测序,进一步证实RT-PCR检测方法的特异性。对IBV的最低检出量为0.6 pg的cDNA。经临床初步应用表明,本方法的建立对IBV的早期诊断和临床检测具有快速、灵敏、特异、经济的特点。  相似文献   

SYBR Green I荧光定量PCR检测类猪圆环病毒因子P1   总被引：3，自引：0，他引：3  

温立斌  何孔旺  杨汉春  郭容利  周俊明  钟书霖 《华北农学报》2009,24(4)

该研究旨在建立快速、敏感和特异的检测类猪圆环病毒因子 P1的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 法,用于 P1 的早期诊断.以感染 P1 的猪血清DNA提取物为模板,采用 PCR 扩增 P1 101 bp 的基因片段,将其克隆至 pMD18-T 载体,重组质粒测序并进行同源性分析;以阳性质粒为模板,建立 SYBR Green I 荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测.经测序证实扩增片段属于 P1,所建立的 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 P1 的反应在 101 ～108拷贝/μL 之间具有良好的线性关系,反应的检出下限为10拷贝/μL,而对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测为阴性,表明该方法敏感、特异.成功建立了 SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测 P1 载量的方法,为 P1 致病机制和机体免疫保护机制的研究提供了技术平台.  相似文献   

猪流感H3N2亚型HA 基因真核表达载体构建及其对小鼠的免疫效果的研究     

刘雪芹  郭万柱 《中国农学通报》2009,25(22)

采用PCR方法扩增出猪流感病毒四川分离株H3N2亚型HA全基因,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,成功构建出真核重组质粒pcDNA3.1-HA.采用纯化后的pcDNA3.1-HA质粒和灭活全病毒以不同的组合免疫4～6周龄的Balb/c小鼠,免疫2次间隔3周,加强免疫3周后,小鼠接种致死量的H3N2病毒;检测免疫后小鼠的血清抗体水平及攻毒后肺部病毒残留.结果表明,pcDNA3.1-HA质粒和灭活全病毒免疫小鼠后,均能够产生一定的免疫效果,能为小鼠提供H3N2亚型猪流感病毒保护.  相似文献   

水稻MOC1 mRNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立     

高东  孙宏伟  刘雪清  何霞红  王云月  李成云  朱有勇 《分子植物育种》2008,6(6)

TA克隆构建含MOC1基因cDNA片段的重组质粒,作为TaqMan定量检测水稻分蘖基因MOC1 mRNA的标准品,建立了检测方法。采用RT—PCR。的方法,从水稻分蘖芽总RNA中逆转录扩增总cDNA,PCR扩增MOC1基因中设计的目的片段,将纯化的目的片段与pMD19-T Simple载体连接,转化宿主菌JM-109,提取重组质粒DNA,PCR鉴定并测序分析。纯化质粒并检测260nm吸光值,确定重组质粒原液的拷贝浓度并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。对重组质粒进行实时荧光定量PCR实验。建立了MOC1基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,检测灵敏度达10^2拷贝,线性范围为10^2-10^7拷贝,阈值循环数与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（r=0．999）,扩增效率高（E=92．8％）。成功建立了MOCI基因实时荧光PCR定量标准品,且TaqMan荧光定量RT—PCR的方法可对水稻分蘖基因MOC1 mRNA的表达进行准确定量。  相似文献   

黄瓜绿斑驳花叶病毒低风险参照物质的研制     

黄峰  陈青  陈红运  白静  李桂芬  余芳平  陈洪俊 《中国农学通报》2009,(4)

采用RT-PCR方法扩增黄瓜绿斑驳花叶病毒的外壳蛋白基因与3,非编码区,并将其构建到马铃薯X病毒(PVX)载体中.重组质粒经线性化及体外转录后接种烟草,获得含有病毒外壳蛋白基因的感病植株.感病组织可用于分子检测的质控,也可作为毒源来繁殖阳性参照物质.基于PVX载体制备的参照物质可降低检疫性病毒的生物安全风险,尤其对稳定性强、可造成严重经济损失的高风险病毒的检疫更具实用价值.  相似文献   

猪流感病毒M基因核酸探针的制备与应用   总被引：5，自引：0，他引：5  

吕翠  马小明  尹燕博  单虎 《华北农学报》2009,24(1)

以地高辛(DIG)标记猪流感病毒(SIV)M基因的保守片段制成核酸探针,与H1及H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA、猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的cDNA、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的DNA、猪瘟病毒(CSFV)cDNA、猪伪狂犬病(PRV)的DNA进行斑点杂交,以检测探针的特异性,结果该探针仅与H1及H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA杂交呈阳性,与其余病毒杂交呈阴性;敏感性试验显示,探针最低能检出约5 pg的H3亚型的SIV RT-PCR产物.应用该探针对35份疑似SI临床病料进行检测,结果检出9份阳性,与RT-PCR检测结果一致.本研究结果表明,建立的DIG标记的核酸探针特异性强,敏感性高,适合于对SI的诊断和流行病学调查.  相似文献   

鸭瘟病毒河南株gG基因的克隆、测序     

崔保安  曹素芳  王岩 《华北农学报》2011,(6):94-96

鸭瘟是鸭的一种急性传染和高致死的病毒性疾病.根据GenBank收录中鸭瘟病毒gG基因序列设计并合成1对引物,以鸭瘟病毒河南分离株DNA为模板,PCR扩增出1条约1 600 bp的含gG基因特异性片段,并将其克隆至PMD19-T载体上.经酶切鉴定,得到含gG基因重组质粒,并对重组阳性质粒进行序列测定.结果表明,gG基因长...  相似文献   

鸡传染性支气管炎病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立     

罗思思谢芝勋  庞耀珊谢志勤邓显文  刘加波谢丽基  彭宜范晴 《中国农学通报》2012,28(20):83-87

为建立一种能快速检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的方法,根据GenBank中IBV的基因保守序列,设计一套环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,建立了IBV RT-LAMP可视化检测方法;该法对IBV RNA最小检测限为10 fg,而常规RT-PCR为1 pg,灵敏度高于常规PCR法100倍;对其他常见鸡病原体检测结果均为阴性;可通过肉眼观察颜色直接判定结果;本研究建立的IBV RT-LAMP方法简便、快捷、特异、灵敏,且只需1个可控温的水浴锅在1 h内即可完成全部反应,更适合基层业务部门及养殖场的检测,为IBV感染的快速检测提供新方法。  相似文献