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将猪流行性腹泻病毒LJB/03株S基因上编码中ps420(1 495～1 916 bp)基因片段插入乳酸乳球菌pNZ8112中,构建了重组表达载体pNZ8112-ps420,将其电转化入乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000,获得了表达猪流行性腹泻病毒S基因ps420的重组乳酸乳球菌,经乳链菌肽(... 相似文献
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【目的】构建猪轮状病毒主要保护性抗原VP4基因的重组乳酸乳球菌口服疫苗,为猪轮状病毒的防治提供有效方法。【方法】将猪轮状病毒免疫保护性抗原基因VP4主要结构功能区定向插入乳酸菌表面表达载体pNZ8112,电转化乳酸乳球菌NZ9000,构建了pNZ8112/NZ9000乳酸乳球菌表面表达系统。通过SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光方法鉴定,以此活菌系统口服免疫6～8周龄Balb/c小鼠,测定了免疫动物的局部体液免疫和系统免疫应答。【结果】证明插入的外源基因在菌体表面得到了正确表达,表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌免疫动物后,分别在粪便、泪液和阴道洗液中检测到了特异性分泌型IgA抗体和在血液中检测到了IgG抗体的存在;体外细胞中和试验结果表明,血清抗体对猪轮状病毒的中和效价为1﹕40。【结论】表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌口服免疫动物能够产生良好的局部和系统体液免疫应答而且具有免疫中和效力。 相似文献
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利用乳酸菌表达系统构建表达抗原蛋白的工程菌是探讨抗原应用的重要手段之一。本研究利用融合PCR技术将信号肽-细胞壁锚定蛋白结构域序列（Usp45-3LysM）分别与绿色荧光蛋白（GFP）、Omicron变异株上S1蛋白的受体结合位点结构域（RBD）序列融合,构建表达载体pNZ8149-GFP、pNZ8149-2RBD、pNZ8149-3RBD,转化乳酸乳球菌NZ3900(Lactococcus lactis NZ3900)构建了GFP、2RBD、3RBD表面展示工程菌菌株。结果表明工程菌受Nisin诱导表达GFP的最佳浓度和时间分别为20 ng/mL和20 h。蛋白质免疫印迹法（Western blot）和间接免疫荧光检测结果证明,3种目的蛋白都成功表达并展示于工程菌的细胞壁上,表明表面展示SARS-CoV-2抗原蛋白乳酸乳球菌工程菌已构建成功。本研究为新冠病毒或其他动物病毒的新型乳酸菌口服疫苗的研制及其相关产品的研发打下基础。 相似文献
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乳酸菌NICE系统是食品级表达系统，本实验以该系统的表达载体pNZ8148和宿主菌NZ9000为研究对象，对电击转化方法进行了优化。结果表明，在培养基中加入2.5%甘氨酸，收集OD600值为0.3的细胞、用配方I[（洗涤液I:蔗糖0.5 mol·L?1+甘油10%；洗涤液II:蔗糖0.5 mol·L?1+甘油10%+EDTA50 mmol·L?1）]洗涤细胞，再转入0.2 μg质粒，利用2.5 kV电压和0.2 cm电击杯进行电击转化，恢复培养1.5 h后转化效率最高，达1.6×108 CFU·μg?1。本实验为乳酸乳球菌NZ9000的电击转化参数提供了数据参考，为基于乳酸菌NICE系统的深入研究奠定了基础。 相似文献
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【目的】构建A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens裂解酶重组表达乳酸菌Lactococcus lactis,并检测重组菌及其表达产物的抗菌效果。【方法】全基因合成噬菌体裂解酶Cp51基因,构建PNZ8148-Cp51原核表达重组载体,电转化至乳酸菌NZ9000,经乳链菌肽诱导表达可溶性Cp51蛋白;用比浊法检测表达蛋白对A型产气荚膜梭菌的抗菌活性;利用细菌液混合培养检测重组菌对A型产气荚膜梭菌增殖的抑制作用。【结果】噬菌体裂解酶Cp51在乳酸菌中成功表达,为1 268 bp;质量浓度1μg·mL-1以上的重组蛋白对A型产气荚膜梭菌具有高效抗菌活性;重组乳酸菌对A型产气荚膜梭菌增殖有一定的抑制效果,混合培养后使产气荚膜梭菌活菌数从9×10~9 CFU·mL~(-1)下降到约9×10~8 CFU·mL~(-1)。【结论】A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶重组乳酸菌构建成功,为后续优化表达和临床应用研究奠定了基础。 相似文献
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克隆灵芝Iz-8基因并进行原核表达,通过动物试验检测其生理活性.根据GenBank公布的Iz-8基因的DNA序列设计引物,从灵芝菌丝中提取灵芝总DNA,PCR扩增k-8基因并连接到乳酸菌食品级表达载体pNZ8149,转化乳酸乳球菌NZ3900,于30℃Nisin诱导3h,SDS-PAGE进行蛋白表达分析.将工程菌菌悬液给小鼠灌胃,对其碳廓清试验等免疫指标进行检测.结果表明:扩增到的Iz-8基因序列全长330 bp,构建了原核表达载体pNZ8149-Iz-8,LZ-8蛋白在NZ3900中得到表达.NZ3900/pNZ8149-Iz-8菌悬液对小鼠各项免疫指标有明显的调节作用. 相似文献
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大肠杆菌O157 Stx噬菌体裂解酶的克隆表达及活性分析 总被引：1，自引：1，他引：0
为研究大肠杆菌O157Stx噬菌体编码的裂解酶(内溶素)对肠出血性大肠杆菌的抗菌作用,克隆表达了大肠杆菌O157Stx噬菌体裂解酶,并检测其裂解作用和裂菌谱。利用PCR方法扩增大肠杆菌O157Min27株中Stx2噬菌体裂解酶基因(R基因),构建表达质粒pET28a(+)-lysEC1,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)。重组质粒在BL21中获得了高表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的34%,经His-trapTM亲和层析柱纯化后,获得的重组LysEC1的纯度大于97%。体外裂解活性试验证实纯化的噬菌体裂解酶LysEC1对肠出血性大肠杆菌菌株具有很好的裂解作用,这为新型噬菌体抗菌生物制剂的研发提供了新的研发方向。 相似文献
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末端酶(terminase)是dsDNA病毒包装过程中的必要功能蛋白,其大亚基单位在包装过程中往往行使全酶的作用,一般具有ATP酶活性和限制性内切酶活性。噬菌体SMP是猪链球菌2型的烈性噬菌体,本研究以SMP基因组为模板,扩增SMP末端酶大亚基单位基因(TlsSMP),构建pEASY-E1-Tls重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达,并对TlsSMP融合蛋白进行活性检测。结果显示,末端酶大亚基单位在大肠杆菌中呈可溶性表达,具有ATP酶生物学活性,在pH7、23℃和Mg2+存在的条件下,其活性最强,其他金属离子如Ca2+、Mn2+和Co2+都对其有不同程度的抑制作用。本研究为进一步研究猪链球菌噬菌体的包装机制奠定基础。 相似文献
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乳酸菌作为宿主系统的可行性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
通过生理、生化特性,抗生素敏感性,转化实验及质粒的提取和鉴定等实验,对嗜酸乳杆菌ATCC4356和乳酸乳球菌NZ9000作为宿主系统的可行性进行研究。结果表明,乳酸乳球菌NZ9000和嗜酸乳杆菌ATCC4356均可作为宿主系统,表达pLP352质粒(氯霉素抗性质粒,可在大肠杆菌和乳酸菌中穿梭)。研究结果,在基因工程上应用抗病基因在乳酸菌中的表达奠定了基础,证实了乳酸菌作为生物安全级别的宿主系统的可行性。 相似文献
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[目的]将特异存在于豆科植物的II型查尔酮异构酶基因CHI1A构建到目前最有效的食品级乳酸乳球菌NICE诱导表达系统中。[方法]利用RT-PCR技术从大豆总RNA中克隆CHI1A基因,连入pMD18-T克隆载体中并进行测序,然后重组到乳酸乳球菌表达载体PNZ8149-CHI1A,利用电穿孔方法转入乳酸乳球菌NZ3900中。[结果]克隆得到CHI1A完整开放阅读框670bp,与已报导序列（GenBankAY595413）的同源性达到99%;通过PCR和酶切鉴定,成功地将CHI1A导入到NICE表达系统中。[结论]含有CHI1A基因的乳酸乳球菌高效诱导表达载体的构建为利用微生物发酵产生类黄酮奠定基础。 相似文献
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According to the sequence of the bile salt hydrolase (BSH) gene of Bifidobacterium and the restriction enzyme cutting sites of expression vector pNZ8148, primers were designed and the bile salt hydrolase (BSH) gene was gotten from Bacillus bifidus ATCC 29521 by PCR. BSH gene was inserted into lactic acid bacteria expression vector pNZ8148 to construct the recombinant pNZ8148-BSH. The recombinant pNZ8148-BSH was transferred into lactic acid bacteria NZ9000 with electrotransformation method. And the recombina... 相似文献
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利用乳酸乳球菌nisin诱导基因表达系统(the Nisin Controlled gene Expression system,NICE)表达TK酶基因.采用基因克隆和表达方法,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定.重组质粒测序结果表明,转化到乳酸乳球菌中的TK基因与pWSTK6基因(登录号为EU530625.1)相... 相似文献
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原核真核双表达加强型绿色荧光蛋白质粒的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
将原核启动子Ptrc和加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因从EGFP原核表达质粒pYA3334—EGFP上切下，然后将其插入至真核表达质粒pVAXI真核启动子Pcmv的下游，构建成具有真核和原核启动子的双表达杂合质粒pVAXD-EGFP，其长度为3823bp。将pVAXD—EGFP分别转化鼠伤寒沙门氏菌X4550和转染COS—7细胞，应用流式细胞术、可见光谱扫描、SDS—PAGE测定EGFP原核表达；应用荧光显微镜观察EGFP在COS—7细胞内的表达。重组鼠伤寒沙门氏茵X4550(pVAXD-EGFP)表达EGFP的量与仅以原核方式表达EGFP的X4550(pYA3334—EGFP)相当；将质料pVAXD-EGFP转染COS—7细胞，EGFP可在COS—7细胞核和胞浆表达，在荧光显微镜下发出强烈荧光。结果表明：不仅成功地构建原核、真核表达集中于同一质粒的新型质粒pVAXD-EGFP，而且原核、真核目的蛋白表达量达到很高水平，显示其在新型重组细菌疫苗方面有着诱人的应用前景。 相似文献
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[目的]改造乳酸乳球菌食品级表达载体,拓宽原系统的应用范围。[方法]以pNZ8149为基础,在pNZ8149的启动子PnisA下游插入乳酸乳球菌MG1363未知分泌蛋白（Usp45）的胞外分泌信号肽基因序列SPusp45,利用特异性引物通过PCR方法删除启动子序列和信号肽基因序列间的酶切位点,确保SD序列和起始密码子间的距离相对最佳,构建分泌表达载体pNZS。将报告基因gus重组到pNZS的多克隆位点中,构建pNZS-gus,电击转化L.lactisNZ3900。以10ng/ml的nisin诱导培养,取培养液进行GUS染色试验。[结果]新构建的L.lactisN3900/pNZS-gus系统可以正确表达有活性的GUS蛋白,并可以将GUS蛋白分泌到细胞外。[结论]该系统的构建成功,为目的蛋白的分泌性表达研究和口服级疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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[目的]改造乳酸乳球菌食品级表达载体,拓宽原系统的应用范围。[方法]以pNZ8149为基础,在pNZ8149的启动子PnisA下游插入乳酸乳球菌MG1363未知分泌蛋白（Usp45）的胞外分泌信号肽基因序列SPusp45,利用特异性引物通过PCR方法删除启动子序列和信号肽基因序列间的酶切位点,确保SD序列和起始密码子间的距离相对最佳,构建分泌表达载体pNZS。将报告基因gus重组到pNZS的多克隆位点中,构建pNZS-gus,电击转化L.lactisNZ3900。以10ng/ml的nisin诱导培养,取培养液进行GUS染色试验。[结果]新构建的L.lactisN3900/pNZS-gus系统可以正确表达有活性的GUS蛋白,并可以将GUS蛋白分泌到细胞外。[结论]该系统的构建成功,为目的蛋白的分泌性表达研究和口服级疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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利用API20E细菌鉴定系统对筛选获得的抗汞菌株PII进行鉴定,并采用高温-SDS对所获抗汞菌株PII进行质粒消除,研究其对PII菌株的去汞特性的影响。结果表明,抗汞菌株PII生化谱为2227004,经API20E生化项分析鉴定系统查询,为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida);抗汞菌株PII含有质粒,其质粒片段在4 kb～5 kb左右,利用高温-SDS法质粒消除率达到62.5%。质粒消除试验表明,抗汞菌株PII的汞去除能力与质粒相关。 相似文献
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太平洋鳕神经坏死病毒衣壳蛋白(CP)的原核表达及条件优化 总被引：1，自引：0，他引：1
为深入研究太平洋鳕Gadus macrocephalus神经坏死病毒(Pacific cod nervous necrosis virus,PCNNV)衣壳蛋白(capsid protein,CP)的功能,将PCNNV cp基因连接到p ET-32a原核表达载体中,构建原核表达重组载体p EVCP,将其转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达系统中进行融合表达,对诱导剂IPTG浓度、诱导时间和温度等诱导表达条件进行优化,采用SDS-PAGE及质谱技术鉴定表达产物。结果表明:本研究中成功构建了重组载体p EVCP,表达的目的蛋白相对分子质量约为55 000;目的蛋白经质谱鉴定,有6个肽段的氨基酸序列与预期一致;对重组菌株p EVCP/BL21的最佳诱导条件为IPTG浓度0.1 mmol/L、最佳诱导时间3 h、温度30℃。本研究结果可为后续冷水鱼类病毒疫苗的研制及病毒快速检测试剂盒的研发奠定基础。 相似文献