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1.
【目的】BOLL作为一个RNA结合蛋白,可通过与其他分子相互作用而在精子发生过程中发挥不可或缺的作用。研究旨在分析藏绵羊BOLL的序列特征及其在睾丸中的表达与分布模式,进而探究其表达调控与潜在的生物学功能,以期为进一步解读BOLL在绵羊精子发生中的作用机制提供必要的思路和分子见解。【方法】选取3月龄（性成熟前）、1岁龄（性成熟）和3岁龄（成年）3个关键发育阶段各8只健康的雄性藏绵羊。以睾丸组织总RNA为模板,采用RT-PCR技术克隆藏绵羊BOLL的完整编码序列（coding sequence,CDS）区;通过相关生物信息学软件对BOLL的序列与结构特征及其互作蛋白进行分析;采用实时荧光定量PCR（quantitative real time PCR,qRT-PCR）, Western blot和免疫荧光染色法对BOLL在3个发育阶段睾丸组织中的表达和免疫定位特征进行检测;基于课题组前期有关藏绵羊睾丸组织全转录组测序数据,借助相关数据库进行绵羊BOLL的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）调控网络和功能注释分析,并采用qRT-PCR和双荧光素酶报告实验对其表达特征及靶向关系进行验证。【结果】藏绵羊BOLL CDS区全长为888 bp,可编码295个氨基酸,含有由81个氨基酸残基组成的RRM结构域（靠近N端）和25个氨基酸残基组成的DAZ重复基序。绵羊BOLL在不同哺乳物种间（特别是山羊、川南山地黄牛和牦牛）具有高度的序列同源性和进化保守性。BOLL蛋白与10个雄性生殖细胞发育相关蛋白质分子间存在潜在的相互作用。随着年龄的增加,在藏绵羊睾丸中BOLL mRNA的表达持续上调,而其蛋白的表达先上调后下调。BOLL蛋白主要存在于性成熟后（1岁龄和3岁龄）睾丸内的精子细胞中,也在精母细胞和整个发育阶段的精原细胞中有少量分布。qRT-PCR结果显示,与3月龄相比,在1岁龄和3岁龄睾丸中微小RNAs（microRNAs,miRNAs）oar-miR-127-5p、oar-miR-382-5p和oar-miR-760-3p的表达量极显著下调（P<0.01）,而长链非编码RNAs（long noncoding RNAs,lncRNAs）LOC105602204、LOC105603195 和LOC105616228以及环状RNAs（circular RNAs,circRNAs）circ-ECT2L和circ-SPHKAP的表达量极显著上调（P<0.01）。oar-miR-127-5p和oar-miR-760-3p明显降低了BOLL 3′UTR野生型的荧光素酶活性,并且oar-miR-760-3p明显降低了野生型Circ-ECT2L和野生型LOC105616228报告基因的荧光素酶活性。【结论】报道了藏绵羊睾丸中BOLL的分子结构特征、表达规律及潜在的表达调控作用。BOLL主要在藏绵羊减数分裂后的圆形和长形精子细胞中表达,并且其表达受到oar-miR-127-5p和oar-miR-760-3p的直接靶向负调控以及oar-miR-760-3p介导的circRNA Circ-ECT2L和lncRNA LOC105616228的正向调控,进而可能与下游信号分子相互作用,以参与调节绵羊精子细胞向成熟精子分化。 相似文献
2.
《中国农业科学》2020,(20)
【目的】BOLL作为一个RNA结合蛋白,可通过与其他分子相互作用而在精子发生过程中发挥不可或缺的作用。研究旨在分析藏绵羊BOLL的序列特征及其在睾丸中的表达与分布模式,进而探究其表达调控与潜在的生物学功能,以期为进一步解读BOLL在绵羊精子发生中的作用机制提供必要的思路和分子见解。【方法】选取3月龄(性成熟前)、1岁龄(性成熟)和3岁龄(成年)3个关键发育阶段各8只健康的雄性藏绵羊。以睾丸组织总RNA为模板,采用RT-PCR技术克隆藏绵羊BOLL的完整编码序列(coding sequence,CDS)区;通过相关生物信息学软件对BOLL的序列与结构特征及其互作蛋白进行分析;采用实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR), Western blot和免疫荧光染色法对BOLL在3个发育阶段睾丸组织中的表达和免疫定位特征进行检测;基于课题组前期有关藏绵羊睾丸组织全转录组测序数据,借助相关数据库进行绵羊BOLL的竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)调控网络和功能注释分析,并采用qRT-PCR和双荧光素酶报告实验对其表达特征及靶向关系进行验证。【结果】藏绵羊BOLL CDS区全长为888 bp,可编码295个氨基酸,含有由81个氨基酸残基组成的RRM结构域(靠近N端)和25个氨基酸残基组成的DAZ重复基序。绵羊BOLL在不同哺乳物种间(特别是山羊、川南山地黄牛和牦牛)具有高度的序列同源性和进化保守性。BOLL蛋白与10个雄性生殖细胞发育相关蛋白质分子间存在潜在的相互作用。随着年龄的增加,在藏绵羊睾丸中BOLL mRNA的表达持续上调,而其蛋白的表达先上调后下调。BOLL蛋白主要存在于性成熟后(1岁龄和3岁龄)睾丸内的精子细胞中,也在精母细胞和整个发育阶段的精原细胞中有少量分布。qRT-PCR结果显示,与3月龄相比,在1岁龄和3岁龄睾丸中微小RNAs(microRNAs,miRNAs)oar-miR-127-5p、oar-miR-382-5p和oar-miR-760-3p的表达量极显著下调(P0.01),而长链非编码RNAs(long noncoding RNAs,lncRNAs)LOC105602204、LOC105603195和LOC105616228以及环状RNAs(circular RNAs,circRNAs)circ-ECT2L和circ-SPHKAP的表达量极显著上调(P0.01)。oar-miR-127-5p和oar-miR-760-3p明显降低了BOLL 3′UTR野生型的荧光素酶活性,并且oar-miR-760-3p明显降低了野生型Circ-ECT2L和野生型LOC105616228报告基因的荧光素酶活性。【结论】报道了藏绵羊睾丸中BOLL的分子结构特征、表达规律及潜在的表达调控作用。BOLL主要在藏绵羊减数分裂后的圆形和长形精子细胞中表达,并且其表达受到oar-miR-127-5p和oar-miR-760-3p的直接靶向负调控以及oar-miR-760-3p介导的circRNA Circ-ECT2L和lncRNA LOC105616228的正向调控,进而可能与下游信号分子相互作用,以参与调节绵羊精子细胞向成熟精子分化。 相似文献
3.
【目的】克隆桔小实蝇丝氨酸蛋白酶基因（Bactrocera dorsalis serine protease,BdorSer）,研究BdorSer在不同组织和不同发育时期的表达情况,探索其可能参与的生理过程。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆BdorSer,对其编码蛋白氨基酸序列信息和进化关系进行分析;采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）方法,研究BdorSer mRNA在桔小实蝇不同组织及不同发育时期的相对表达量。【结果】克隆获得了BdorSer,该基因ORF全长1 239 bp。氨基酸序列一致性分析表明,BdorSer与拟暗果蝇（Drosophila pseudoobscura）丝氨酸蛋白酶（登录号XP_001352960）氨基酸序列的一致性最高,为65.8%。实时荧光定量PCR分析表明,BdorSer mRNA在桔小实蝇雌雄虫的不同组织中都有表达,且在触角中的表达量最高,分别是雌虫胸部的43.6和26.8倍。BdorSer mRNA在生殖节中表现出较大的性别差异表达特征,雄虫生殖节中的mRNA表达量是雌虫的18.25倍。BdorSer mRNA几乎在昆虫发育的各个时期都有表达,其中在卵及1,2,3龄幼虫中的表达量分别是10 d 蛹的 0.68,1.63,4.31和15.8倍。BdorSer mRNA随蛹的发育其表达量逐渐减低,1,4,7 d蛹中的表达量分别是10 d蛹的325,125和41倍。【结论】克隆获得了BdorSer,其表达的BdorSer蛋白可能在雄虫的生殖生理中发挥了作用,同时也可能参与了桔小实蝇的变态发育过程,尤其是1 d蛹的发育过程。 相似文献
4.
【目的】分析SP1基因在从江香猪不同组织及不同发育阶段睾丸中的表达情况及其对睾丸间质细胞自噬、凋亡的转录调控作用,为探究SP1基因调控间质细胞自噬的分子机制及提高从江香猪雄性繁殖性能提供理论基础。【方法】选取性早熟的从江香猪作为研究对象,PCR扩增得到其SP1基因编码区（CDS）序列,应用相关在线软件对CDS序列进行生物信息学分析,荧光定量PCR检测性成熟期从江香猪不同组织中SP1表达量,利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测不同日龄从江香猪睾丸中的SP1基因表达量。【结果】生物信息学分析结果显示,SP1基因CDS序列全长为2361 bp,编码786个氨基酸残基,蛋白二级及三级结构以无规则卷曲和延伸链为主,无跨膜结构域和信号肽剪切位点,且为不稳定蛋白。SP1氨基酸序列有174个磷酸化位点,通过氨基酸同源性分析发现猪SP1与绵羊和牛的亲缘关系最近。对SP1在各组织的表达量进行检测,结果表明SP1基因相对表达量在脾脏中最高;此外,SP1的蛋白水平在180 d的香猪睾丸中有最高表达量,基因水平在30和180 d的香猪睾丸中有较高表达量。进一步构建SP1基因超表达载体,转染至从江香猪睾丸间质细胞,结果显示pEGFP-C1-SP1组的SP1相对表达量显著高于pEGFP-C1组（P<0.05,下同）,而自噬通路相关因子基因mTOR、LC3B、Beclin-1和凋亡相关因子基因Caspase-3、Bcl-2的相对表达量在超表达pEGFP-C1-SP1组显著低于pEGFP-C1组,但自噬凋亡信号因子ERK1/2和凋亡基因Bax的相对表达量无显著变化（P>0.05）。推测SP1基因可通过降低LC3B、Beclin-1、Caspase-3的表达来抑制睾丸间质细胞自噬凋亡的发生,或通过降低mTOR及抗凋亡基因Bcl-2的表达来促进凋亡发生。【结论】 SP1基因在从江香猪不同组织及睾丸发育不同阶段均有表达,且通过影响睾丸间质细胞自噬、凋亡相关基因表达,而在从江香猪初情期和性成熟期发挥重要的生理学作用。 相似文献
5.
【目的】研究内皮性一氧化氮合酶(endothelial NOS,eNOS)在高原地区成年藏绵羊和小尾寒羊睾丸组织中的定位及分布特征.【方法】采用免疫组化SP法结合半定量法描述染色结果分布密度,蛋白免疫印迹(Western blot,WB)分析比较.【结果】eNOS免疫组织化学分布密度表明,小尾寒羊睾丸精子细胞和精原细胞强阳性表达,而在藏绵羊精子和精原细胞内无明显表达;小尾寒羊间质细胞(leydig cell)和支持细胞(sertoli cell)为中等阳性表达,在藏绵羊弱阳性表达.eNOS在藏绵羊及小尾寒羊小血管均为阳性表达.Western免疫印迹显示eNOS抗体有较好的反应性,且小尾寒羊睾丸组织蛋白反应性强于藏绵羊睾丸组织提取蛋白.【结论】高原环境中,eNOS可参与调节高原地区绵羊睾丸局部血管舒缩以适应环境温度变化;小尾寒羊生精上皮eNOS表达较强可能是高寒环境中精子生成过程中的低氧应激反应的一个方面. 相似文献
6.
【目的】研究Borealin在小鼠早期胚胎及睾丸中的表达情况,初步探讨Borealin的生物学功能。【方法】利用体外合成RNA探针,采用全胚胎原位杂交检测Borealin基因在9.5～10.5日龄小鼠胚胎中的表达,免疫组化检测Borealin基因在成年小鼠睾丸中的表达,RT-PCR等方法检测Borealin基因在成年小鼠多组织中的表达。【结果】Borealin在小鼠9.5～10.5日龄胚胎的头部和成年小鼠生精小管基底部细胞的部位有较强的表达,在睾丸、卵巢、肠以及眼睛组织中的表达量较其他组织高。【结论】Borealin在小鼠9.5～10.5 日龄胚胎头部及成年小鼠睾丸中均有特异性表达,可能参与了成体干细胞功能的维持。 相似文献
7.
【目的】研究生物钟基因调控牦牛睾酮分泌的分子机制，为生物钟靶向调控牦牛繁殖力提供理论依据。【方法】于清晨08:00左右（ZT0）和下午20:00左右（ZT12）采集雄性牦牛的血液和睾丸，用ELISA检测牦牛血清睾酮含量是否存在昼夜节律性表达；用IHC法检测生物钟蛋白Bmal1在睾丸中的表达定位；采用普通PCR法检测生物钟基因（Bmal1、Dbp、Nr1d1、Per1）在牦牛睾丸中的表达；采用实时荧光定量PCR法检测生物钟基因、类固醇合成基因(StAR、Hsd3b1、Hsd17b3、Cyp11a1）和核受体基因（Sf1、Nr4a1、Lhcgr、Nr0b1）在牦牛睾丸中的时空表达规律；用蛋白免疫印迹（WB）检测生物钟蛋白Bmal1和类固醇合成蛋白StAR在牦牛睾丸中的表达变化；用生物信息学预测牦牛睾酮合成相关因子启动子区域生物钟作用元件。【结果】牦牛体内睾酮含量存在昼夜节律性表达，ZT0时的含量极显著低于ZT12（P＜0.001）；生物钟蛋白Bmal1在牦牛睾丸中存在节律性表达，主要分布在睾丸间质细胞中；4个生物钟基因、类固醇合成基因Hsd17b3和Cyp11a1及核受体基因Nr4a1、Lhcgr和Nr0b1在牦牛睾丸中均存在节律性表达；类固醇合成蛋白StAR在牦牛睾丸中有表达，但无节律性；牦牛类固醇合成相关基因启动子区域存在与生物钟基因结合的E-box、RORE和D-box元件。【结论】牦牛睾丸生物钟基因通过调控类固醇合成相关基因的表达，影响睾酮的分泌水平。 相似文献
8.
【目的】分析沉默信息调节因子1(SIRT1)在黔北麻羊不同月龄睾丸组织与12月龄性腺轴组织中的表达水平,以及对睾丸间质细胞发育及抗氧化能力的影响,为探明SIRT1基因调控睾丸间质细胞生长发育机制提供理论基础。【方法】以1、3、6、9和12月龄健康的黔北麻羊公羊为研究对象,采用实时荧光定量PCR检测不同月龄睾丸组织及12月龄性腺轴组织（下丘脑、垂体、睾丸和附睾）中SIRT1的表达量;将过表达载体pEGFP-N3-SIRT1和空载体pEGFP-N3转染至山羊睾丸间质细胞,运用CCK-8法检测细胞的增殖情况,划痕试验检测细胞迁移效率,利用实时荧光定量PCR检测细胞增殖、发育及抗氧化相关基因的表达量。【结果】SIRT1基因在3、6、9和12月龄睾丸组织中的表达水平均显著高于1月龄（P<0.05,下同）,以12月龄的相对表达量最高;在性腺轴上,睾丸组织中SIRT1基因相对表达量显著高于下丘脑、垂体和附睾。CCK-8法结果显示,过表达SIRT1基因在12 h后极显著促进睾丸间质细胞的增殖（P<0.01）;划痕试验发现,过表达SIRT1基因组在9和18 h的细胞迁移率均显著高于空载体组;... 相似文献
9.
【目的】从牦牛和犏牛睾丸组织中分离培养支持细胞，检测骨形态发生蛋白4基因（BMP4）及其受体基因在牦牛、犏牛睾丸组织及支持细胞中的表达情况，为深入研究BMP4对犏牛精子发生过程的作用提供理论基础。【方法】采集12月龄牦牛和犏牛睾丸组织，使用Trizol法提取各睾丸组织总RNA，利用RT-PCR技术检测BMP4及其受体基因（骨形态发生蛋白受体1B型(ALK6)、骨形态发生蛋白受体2型(BMPR2)、激活素A受体2A型(ACVR2A)、激活素A受体2B型(ACVR2B)）的mRNA表达水平。通过两步酶法消化睾丸组织制备细胞悬液，经差速贴壁、饥饿处理和胰酶消化分离纯化牦牛和犏牛睾丸支持细胞。采用HE染色、油红O染色、碱性磷酸酶（ALP）染色、免疫荧光染色鉴定支持细胞，用Trizol法提取细胞总RNA，RT-PCR检测支持细胞、生精细胞、间质细胞、类肌细胞标志基因和BMP4及其受体基因的mRNA表达水平。采用实时荧光定量PCR检测BMP4及其受体基因在牦牛和犏牛睾丸支持细胞中的差异表达情况。【结果】HE染色结果显示，第3代（F3）支持细胞呈长条形或梭形。油红O染色结果显示，体外培养的细胞胞质中有明显脂滴积累，且在细胞核内可观察到支持细胞特有的双极小体结构。ALP染色结果显示，细胞不着色。免疫荧光染色结果显示，支持细胞标志蛋白GATA 结合蛋白4(GATA4）呈阳性表达。RT-PCR检测结果显示，支持细胞标志基因BMP4、SRY-box转录因子9基因（SOX9）、波形蛋白基因(Vimentin)、Wilm肿瘤抑制基因(WT1)、FAS细胞表面死亡受体基因(FAS）和胶质细胞源性神经营养因子基因(GDNF)存在明显表达，而生精细胞标志基因出局区解旋酶4(DDX4)和类肌细胞标志基因半胱氨酸的血管生成诱导剂61(CYR61)无明显表达，间质细胞标志基因细胞色素P450家族11亚家族A成员1(CYP11A1)则有少量表达。BMP4在牦牛和犏牛睾丸支持细胞中都有表达，且在牦牛支持细胞中的表达量显著高于犏牛支持细胞，而其受体基因ALK6、BMPR2、ACVR2A和ACVR2B在牦牛支持细胞中的表达量显著或极显著低于犏牛支持细胞。【结论】从牦牛和犏牛睾丸组织中分离获得支持细胞，BMP4在牦牛支持细胞中表达量较高，暗示BMP4对犏牛精子发生具有潜在调控作用。 相似文献
10.
【目的】克隆青海湖裸鲤慢收缩骨骼肌型肌钙蛋白I基因(TNNI1)和快收缩骨骼肌型肌钙蛋白I基因(TNNI2),分析其在不同组织及盐碱胁迫环境下皮肤和腹侧肌肉组织中的表达水平,为揭示青海湖裸鲤生长缓慢及恢复青海湖裸鲤鱼类资源提供基础数据。【方法】以青藏高原特有鱼类青海湖裸鲤为研究材料,利用RACE技术克隆TNNI1和TNNI2基因全长cDNA序列,进行氨基酸序列同源性比对;利用实时荧光定量PCR法检测2个基因在青海湖裸鲤鳃、眼、脑、脾脏、肝脏、肠、肾、心、皮肤、腹侧肌肉组织的表达情况,以及盐碱胁迫下腹侧肌肉和皮肤组织中的表达规律。【结果】青海湖裸鲤TNNI1 cDNA序列全长为1 211 bp,其中开放阅读框540 bp,共编码179个氨基酸;TNNI2 cDNA序列全长为737 bp,其中开放阅读框531 bp,共编码176个氨基酸。序列同源性分析发现,青海湖裸鲤TNNI1氨基酸序列与安水金线鲃的同源性高达92.13%,TNNI2氨基酸序列与鲤鱼的同源性最高为92.61%。系统发育树结果显示,从TNNI1氨基酸序列来看,青海湖裸鲤与金线鲃属鱼类、鲫鱼、鲤鱼的亲缘关系较近;从TNNI2氨基酸序列来看,青海湖裸鲤与鲤鱼的亲缘关系最近,其次是鲫鱼和金线鲃属鱼类。TNNI1和TNNI2基因在青海湖裸鲤不同组织中均有表达,且在腹侧肌肉中相对表达量最高。盐碱胁迫条件下,TNNI1和TNNI2基因在肌肉组织中的相对表达量均显著下调;在皮肤组织中TNNI1的相对表达量极显著下调（P＜0.01）,而TNNI2极显著上调（P＜0.01）。【结论】成功克隆了青海湖裸鲤TNNI1、TNNI2基因全长;TNNI1、TNNI2基因在腹侧肌肉组织中高表达,表明其与肌肉组织发育密切相关;盐碱胁迫条件下TNNI1、TNNI2基因在腹侧肌肉组织中的表达均显著下调,提示2个基因表达量降低可能是青海湖裸鲤生长缓慢的重要因素。 相似文献
11.
【目的】克隆山羊Eda基因CDS区全序列,并对其进行序列分析,研究Eda基因在毛囊生长周期不同阶段皮肤组织中的表达规律。【方法】以太行黑山羊为研究对象,采集其毛囊生长休止期、生长期和退行期背部皮肤组织,采用RT-PCR技术克隆山羊Eda基因,通过在线软件Blastn进行基因cDNA序列分析,用SMART进行氨基酸序列分析,利用SWISS-MODEL软件进行蛋白质结构分析;以β-actin为看家基因,采用实时荧光定量PCR技术对 mRNA在毛囊生长不同时期皮肤组织中的表达规律进行分析。【结果】太行黑山羊Eda-A1基因CDS区全长1 176 bp,编码391个氨基酸;Eda-A2比Eda-A1少6个碱基（nt1161-1166）,编码389个氨基酸;山羊Eda蛋白氨基酸序列相似性在不同物种间均大于90%。SMART分析表明,CDS编码的蛋白质包含了TNF、跨膜区以及胶原等结构域。SWISS-MODEL软件预测结果表明,Eda-A2与Eda-A1在蛋白质表面结构上存在明显差异。毛囊退行期的皮肤组织中,Eda mRNA表达量最高,且极显著高于毛囊休止期和毛囊生长期（P＜0.01）,毛囊生长期的表达量中等且显著高于休止期（P＜0.05）,毛囊休止期的表达量较低。【结论】Eda基因CDS区在物种间保守性较强,Eda mRNA在毛囊生长周期不同阶段表达量有差异,推测Eda基因对毛囊生长周期的调控有一定影响。 相似文献
12.
【目的】克隆桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)P450基因,研究其在不同组织及发育时期的表达情况,探索其可能存在的生理功能。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术,克隆桔小实蝇P450基因CYP6A41;采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）方法,研究CYP6A41mRNA在桔小实蝇不同组织及不同发育时期的相对表达量。采用Homology程序模拟构建CYP6A41蛋白的三维结构,应用CDOCK程序将之与甲酸乙酯、乙酸乙酯、甲基丁香酚3种气味分子进行模拟对接分析。【结果】克隆获得了桔小实蝇P450基因,并命名为CYP6A41。CYP6A41阅读框全长1 530 bp,编码509个氨基酸,该蛋白序列与桔小实蝇的另外一种P450蛋白CYP4D46序列的一致性最高,达99.2%。荧光定量PCR分析表明,CYP6A41在桔小实蝇不同发育时期都有表达,并且在化蛹第1天表达量达到最高峰;CYP6A41在各组织中也都有表达,但以触角中的表达量最高;雄虫生殖节中的表达量约是雌虫的6.8倍;对接结果表明,CYP6A41蛋白与3种小分子化合物均能形成稳定的复合物。【结论】CYP6A41在桔小实蝇雌雄生殖节中的差异表达,暗示该蛋白在雄虫生殖生理过程中发挥作用;CYP6A41在化蛹第1天及触角中的高表达量暗示CYP6A41不仅参与了蛹早期的发育过程,且可能参与了嗅觉气味分子的降解过程。 相似文献
13.
【目的】研究TRIM8基因在小鼠组织和早期胚胎中的表达情况及其沉默后对早期胚胎体外发育的影响。【方法】采用RT-PCR、免疫印迹分别检测TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠不同组织（心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、肌肉、子宫、卵巢和睾丸）中的表达情况,采用免疫组化技术对TRIM8在卵巢中进行定位。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、免疫印迹法检测TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠早期胚胎（1-细胞胚胎、2-细胞胚胎、4-细胞胚胎、8-细胞胚胎、桑葚胚和囊胚）中的表达规律,用免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术对TRIM8在早期胚胎中进行定位。利用RNA干扰技术沉默TRIM8基因,研究该基因沉默对小鼠早期胚胎体外发育的影响。【结果】TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠不同组织中均表达,但在子宫、卵巢和睾丸中表达水平相对较高。在卵巢中,TRIM8蛋白主要定位在不同发育阶段的卵母细胞中。TRIM8基因及其编码的蛋白在早期胚胎中均有表达,但其mRNA表达水平在1-细胞到4-细胞期胚胎中的表达水平显著高于8-细胞到囊胚期胚胎。TRIM8蛋白主要定位在不同时期胚胎的胞质中。TRIM8基因沉默组的囊胚率显著低于对照组(P<0.05)。【结论】TRIM8基因及其编码的蛋白在小鼠各组织及早期胚胎中均有表达,主要定位在早期胚胎的胞质中;沉默TRIM8基因会显著降低囊胚发育率。TRIM8可能参与调控小鼠早期胚胎的发育进程。 相似文献
14.
【目的】对西瓜类甜蛋白家族基因（ClTLP）进行全基因组鉴定和序列特征及聚类分析,研究其在西瓜不同组织及病原菌胁迫下的表达模式,为进一步开展类甜蛋白家族基因的功能鉴定及其与枯萎病菌互作机制研究奠定基础。【方法】利用生物学软件对ClTLP进行序列特征及聚类分析,采用qRT-PCR技术检测ClTLP基因在西瓜根、茎、叶组织及枯萎病菌侵染不同时间（0,12,24,48,120,168 h）后的表达情况。【结果】从西瓜基因组中共鉴定到28个西瓜TLP家族基因,TLP基因分布在 8条染色体上,主要有4种结构类型,蛋白保守,氨基酸基序高度一致。在基因启动子区发现多个激素响应元件和胁迫响应元件。西瓜类甜蛋白归属10个聚类群。多数ClTLP基因在西瓜不同组织中表现为组成型表达,在根中的表达量高于茎和叶片。枯萎病菌侵染可以诱导大部分ClTLP基因的表达,且多数基因表达量在侵染后120 h最高。其中,Cla97C01G019790和Cla97C10G185250的表达随枯萎病菌侵染时间延长逐渐升高,而Cla97C10G204510和Cla97C10G185260的表达受到了枯萎病菌胁迫抑制。【结论】西瓜类甜蛋白家族有28个成员,其大多数CITLP基因的表达量在根中最高,可受枯萎病菌诱导,在西瓜抵御病原菌侵染过程中发挥重要作用。 相似文献
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【目的】阐明生长素(Ghrelin)及其mRNA在大鼠卵巢和睾丸中的分布。【方法】取成年SD大鼠的睾丸和卵巢,制成石蜡切片,采用免疫组化和原位杂交方法,分别检测Ghrelin和Ghrelin mRNA在大鼠性腺组织中的定位。【结果】雄性大鼠睾丸间质细胞、支持细胞、初级精母细胞、次级精母细胞中均有Ghrelin分布,而精原细胞、精子细胞、肌样细胞中均无Ghrelin分布;Ghrelin mRNA的分布规律与Ghrelin一致。在雌性大鼠卵巢中,Ghrelin主要分布在黄体细胞、卵巢门间质细胞、卵母细胞上;Ghrelin mRNA在黄体细胞、卵巢门间质细胞、原始卵泡、初级卵泡的颗粒层细胞、次级卵泡的卵泡膜层细胞和颗粒层细胞中均有分布。【结论】Ghrelin及其mRNA在大鼠性腺中均有分布,可能对大鼠性腺的发育及其功能有一定的调控作用。 相似文献
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牦牛和犏牛Dmc1基因序列分析及睾丸组织转录水平研究 总被引：3，自引：3，他引：0
【目的】研究牦牛和犏牛Dmc1基因编码区序列、结构和睾丸组织mRNA表达水平,探讨Dmc1基因与犏牛雄性不育的关系,为揭示犏牛雄性不育的分子机理提供参考。【方法】通过PCR扩增和克隆测序获得牦牛和犏牛Dmc1基因部分cDNA序列,运用生物信息学方法分析牦牛和犏牛Dmc1基因编码区序列、蛋白结构和进化关系,利用实时荧光定量PCR技术检测牦牛和犏牛睾丸组织中Dmc1基因mRNA表达水平。【结果】牦牛和犏牛Dmc1基因编码区序列全长均为1 023 bp,编码340个氨基酸,与黄牛Dmc1基因的同源性为100%,与哺乳纲其它物种的同源性在90%以上。牦牛和犏牛Dmc1蛋白含有RecA蛋白家族典型的第二结构域,且与人、鼠Dmc1蛋白结构域一致。系统发育分析显示牦牛、犏牛和黄牛首先聚为一类,后与家犬相聚;人、黑猩猩和猕猴聚为另一类,而与鸟纲动物相聚较远,与经典分类基本一致。定量结果显示犏牛睾丸组织Dmc1基因mRNA表达水平较低,与牦牛差异极显著(P＜0.01),且犏牛表现出来的减数分裂障碍表型与小鼠Dmc1基因突变或敲除的表型一致。【结论】根据生物信息学分析结果推测牛Dmc1蛋白与人、鼠一样,在精母细胞减数分裂同源重组过程中发挥着重要作用;Dmc1基因在牦牛和犏牛睾丸组织中的表达量差异极显著(P＜0.01),结合犏牛雄性减数分裂障碍表型,表明睾丸组织Dmc1基因可能与犏牛的雄性不育有一定的关系。 相似文献
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【目的】通过生物信息学分析,将苹果的一段EST序列初步定性为转录因子MdHB-1基因,对该基因进行克隆和真核表达载体构建,为进一步研究其分子生物学功能奠定基础。【方法】根据番茄LeACO-1转录因子LeHB-1的基因序列,对苹果EST库进行Blast,获得一段EST序列,根据该EST序列设计1对特异性引物,以“皇家嘎啦”苹果花器总RNA为材料,经RT-PCR得到1条长约1 000 bp的cDNA片段,T/A 克隆后进行序列测定及分析。将基因MdHB-1与真核表达载体pPICZA连接,构建真核表达载体pPICZA-MdHB-1,并导入毕赤酵母菌种GS115,通过 PCR鉴定该载体的导入情况。【结果】克隆到苹果MdHB-1基因(GenBank登录号为JQ678788),其开放阅读框为1 011 bp,编码336个氨基酸。Blastn和Blastp序列比对分析发现,MdHB-1与已登录的其他物种的HB-1基因相似性达50%～60%。该基因编码的氨基酸中存在保守序列HD-Zip结构域,该保守序列与已经报道的番茄LeHB-1、拟南芥AtHB-1的保守序列的同源性均大于85%。重组表达载体PICZA-MdHB-1构建正确并已成功导入酵母基因组中。【结论】成功克隆了苹果转录因子MdHB-1基因全长,并正确构建了其真核表达载体。 相似文献
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为分析绒山羊JAG1蛋白结构特征,及其在不同毛囊生长期中的表达模式,从阿拉善种羊场选择2周岁、体重相近的3只内蒙古绒山羊母羊,利用生物信息学方法比对绒山羊JAG1氨基酸序列与其他物种的相似性,分析JAG1蛋白质理化性质和结构特征;利用免疫组化和实时荧光定量PCR检测其在内蒙古绒山羊皮肤中的表达部位和表达量。结果表明,绒山羊JAG1氨基酸序列与绵羊相似性可达99.5%,JAG1蛋白信号肽位于第1~29个氨基酸序列,含有一个剪切位点和一个跨膜结构,具有61个丝氨酸、26个苏氨酸、19个酪氨酸磷酸化位点,63个O-糖基化位点,6个N-糖基化位点,属于不稳定亲水蛋白。在毛囊退行期(1月份)和休止期(4月份)未检测到JAG1蛋白的表达;生长前期(7月份)和生长期(9月份)在毛乳头细胞中表达。JAG1 mRNA在内蒙古绒山羊皮肤毛囊的4个时期均有表达,随着毛囊进入生长期JAG1 mRNA表达量逐渐增加,生长期皮肤中的表达量显著高于其他阶段(P<0.05)。综上,绒山羊JAG1氨基酸序列在物种进化过程中比较保守,JAG1 mRNA在内蒙古绒山羊毛囊生长前期和生长期表达升高,为深入研究绒山羊JAG1基因对毛囊发育的调控提供理论依据。 相似文献
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【目的】对猪脂肪组织RNA的Solexa测序结果进行分析整理,发现猪新转录本CHPT1基因。研究CHPT1在猪不同组织及脂肪细胞不同分化阶段的表达谱,以便为后续的基因功能研究奠定基础。【方法】取猪的背部脂肪组织提取RNA,建立cDNA文库,进行Solexa测序,对测序结果进行生物信息学分析。利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）及实时荧光定量PCR,克隆猪CHPT1基因的CDs区部分序列,并对其在不同组织及脂肪细胞不同分化阶段的表达谱进行分析。【结果】由Solexa测序分析结果发现,猪存在新转录本基因CHPT1,其对应的Tag表达量在180日龄大白猪与240日龄荣昌猪的脂肪组织中无明显差异,在3日龄与240日龄荣昌猪脂肪组织中表达差异达到20倍以上。克隆获得了其CDs区193 bp的cDNA序列。实时荧光定量PCR检测结果表明,CHPT1基因在3日龄和180日龄大白猪的各个组织中均有表达,其中在肝脏和肾脏中表达量较高,且表达量有差异。3日龄与180日龄大白猪相比,肾脏和脂肪组织中CHPT1的表达量均有显著差异。在猪前体脂肪细胞的时序表达结果中,CHPT1表达量呈先增加后降低的趋势,其中第2天表达量明显升高,于第6天达到最大值,之后降低。【结论】猪存在CHPT1基因,其在猪的各个组织中都有表达,对猪的脂肪沉积可能发挥着重要作用。 相似文献
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[目的]本试验旨在探究神经介素B(NMB)及其受体NMBR[还包括胃泌素释放肽受体(GRPR)和蛙皮素受体(BRS3)]在山羊不同发育阶段睾丸组织中的差异表达，为解析哺乳动物睾丸发育及功能调节机制提供参考。[方法]选取系谱清晰和体况良好的雄性山羊12只(3月龄和9月龄，各6只)进行阉割并采集睾丸组织，在克隆NMB及其受体基因与分析序列的基础上，采用免疫组化技术检测NMB及其受体在睾丸组织中的表达定位，利用RT-qPCR和Western blot检测NMB及其受体在不同发育阶段山羊睾丸组织中的表达变化。[结果]NMB及其受体基因与绵羊和牛的进化关系最近，NMB及其受体基因编码区的核苷酸序列与牛和绵羊的同源性达96%以上，结构分析发现NMBR、GRPR和BRS3均属于7次跨膜受体。NMB及其受体在3月龄和9月龄山羊睾丸组织中广泛表达，其中在间质细胞、肌样细胞和精子细胞中呈高表达。与3月龄山羊相比，9月龄山羊睾丸组织中NMB与GRPR的mRNA和蛋白表达量显著降低(P<0.05),而NMBR与BRS3的mRNA和蛋白表达量显著增加(P<0.05)。[结论]NMB及其受体可能参与山... 相似文献