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松墨天牛携带的松材线虫PCR检测技术 总被引：3，自引：0，他引：3
利用本研究筛选出的一对松材线虫特异性PCR引物(上游引物:5'-CTACGTGCTGTTGTTGAGTTGGC-3',下游引物:5'-TGGTGCCTAACATTGCGCGA-3'),从松材线虫DNA中,扩增出一条长度403 bp(基因库登陆号:DQ855275)的特异性DNA片段.该引物可以将松材线虫DNA与松墨天牛组织以及拟松材线虫、畸刺伞滑刃线虫、变异伞滑刃线虫、小角伞滑刃线虫、利昂伞滑刃线虫、湖南伞滑刃线虫、红松滑刃线虫、滑刃属线虫、斯坦纳长尾线虫、小茎线虫、剑尾齿杆双胃线虫和寄生小杆属线虫等12种线虫的DNA区分开来.在此基础上,建立一套利用PCR技术直接从受感染的松墨天牛组织中检测出松材线虫的技术,并在实际运用中得到检验. 相似文献
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松材线虫SCAR标记与检测技术 总被引：1，自引：0，他引：1
将松材线虫RAPD特异片段OPM05-X2100进行分离、回收,与载体pGEM-TVector连接,转化大肠杆菌并培养,对目标克隆测序。根据测序结果,用Oligo5.0软件设计引物,正向引物为M05F2(5’-CGGGT CATGG CTGGA GGTAT CGT-3’),反向引物为M05R1(5’-TGGCT CAATG GCAAA TCCTT CGTA-3’),成功地将松材线虫特异片段OPM05-X2100通过引物对M05F2/R1转化为SCAR-M05-X600。运用SCAR标记引物M05F2/R对枯死松树体内分离的92份线虫样本的DNA进行标记,并对单条线虫经简易方法提取的DNA进行检测。结果表明:引物组合对所有81份松材线虫株系均扩增出一条600bp的清晰、明亮的条带,而对8份拟松材线虫、1份霍夫曼尼伞滑刃线虫、1份大核滑刃线虫、1份长尾属线虫均无扩增产物。该对引物可以检测单条松材线虫。利用这对特异引物组合可构建松材线虫检测试剂盒,实现对松材线虫的快速检测的目标。 相似文献
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基于TaqMan实时荧光PCR的拟松材线虫分子鉴定技术 总被引：1，自引：0，他引：1
《中国森林病虫》2021,(5)
拟松材线虫与松材线虫的亲缘关系极为接近,是松材线虫病病原鉴定的主要干扰物种。为了排除松材线虫病病原鉴定过程中拟松材线虫的干扰,采用TaqMan实时荧光PCR技术,以核糖体DNA内转录间隔区(ITS)为模板设计拟松材线虫特异性引物和TaqMan探针,开展拟松材线虫分子检测和鉴定技术研究。结果表明:拟松材线虫ITS2区域存在较多的碱基差异,以此为模板设计的拟松材线虫引物和TaqMan探针组合具有较强的特异性;该组合灵敏性高,能够实现对拟松材线虫单条线虫甚至单个卵的分子检测和鉴定。结合现有的松材线虫分子鉴定技术,可以为进一步构建松材线虫双重检测技术体系奠定基础,为林业和海关检疫提供可靠的技术支撑。 相似文献
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【目的】本研究旨在探索快速、简便地直接从病木中提取松材线虫 DNA 的方法。【方法】运用 Chelex-100结合异硫氰酸胍蛋白变性缓冲液建立新的高效快速提取微量木块中线虫 DNA 的方法,并通过普通 PCR 与环介导等温扩增( LAMP)对提取的 DNA进行检测验证。【结果】建立了提取线虫 DNA 的新方法 Chelex-100法,并对影响提取效率的Chelex-100浓度、冻融时间和煮沸时间进行了优化。Chelex-100法最适Chelex-100终浓度为1.5%( W/V),最适冻融时间为5 min,最适煮沸时间为8 min。与传统的 CTAB法和蛋白酶 K 法比较,Chelex-100法提取的 DNA得率高,相同条件下,该方法提取的 DNA浓度远远大于常规方法。3种方法的 OD260/280比值从大到小依次为CTAB法＞蛋白酶K法≥Chelex-100法,Chelex-100法的OD260/280值显著低于CTAB法,而略低于或等同于蛋白酶K法,但这并不影响对提取的 DNA 进行 PCR 扩增。采用 Chelex-100法提取松木中松材线虫的 DNA,结合常规的PCR和 LAMP检测,检测灵敏度高,特异性强,稳定性好;提取的松材线虫 DNA 的75倍稀释液再稀释32倍后进行PCR扩增,扩增产物电泳依然有清晰的条带。用新方法提取病木中线虫的 DNA 后进行检测,所有带病松木样品的检测结果均呈阳性,而健康黑松、马尾松、油松木屑及盘多毛孢样品的检测结果均呈阴性。此外,该提取方法简便快速,20 min内即可完成整个 DNA的提取;经济方便,试剂保藏无特殊要求,单个样品提取耗费低于3.5元。【结论】Chelex-100法是一种快速有效的提取松木中松材线虫DNA的方法,此方法结合PCR和LAMP检测技术将进一步提高松材线虫的检测效率、灵敏度和准确性,可为松材线虫的野外检测提供可靠的技术依据。 相似文献
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《湖南林业科技》2007,34(1):62-62
2006年5月，由南京林业大学森林资源与环境学院叶建仁教授主持完成的“松材线虫SCAR标记与系列分子检测技术及试剂盒研制”通过了江苏省科技厅组织的科技成果鉴定。该项研究对松材线虫与拟松材线虫特异片段进行了系统筛选，共获得了7个松材线虫DNA特异片段与5个拟松材线虫DNA特异片段，为松材线虫与拟松材线虫的分子鉴定奠定了基础。首次将2个松材线虫与2个拟松材线虫的DNA特异片段成功转化为SCAR标记，丰富了松材线虫与拟松材线虫分子标记方法。首次采用SCAR标记方法成功构建了松材线虫检测试剂盒，PCR检测过程仅需2．2小时。首次成功标记了一个可用于检测松材线虫的非放射性探针DIG-F2／R1。用该探针对线虫基因组DNA点杂交，松材线虫均表现有较强的杂交信号，而拟松材线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、大核滑刃线虫、长尾属线虫等均无杂交信号。 相似文献
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【目的】研究松材线虫Bxy-cul-1基因的表达特性和生物学功能,明确该基因在松材线虫生长发育中的作用,为从生长发育角度探索特异性的线虫种群增长控制措施提供理论基础。【方法】根据松材线虫基因组数据设计引物、克隆Bxy-cul-1基因,对Bxy-cul-1进行序列、系统发育和蛋白结构预测等生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR技术和原位杂交技术探究Bxy-cul-1基因在松材线虫各龄期的表达水平和表达部位,明确其时空动态表达特性,采用RNA干扰技术探究该基因在松材线虫生长发育中的作用。【结果】生物信息学分析结果显示,Bxy-cul-1基因CDS全长2 292 bp,编码763个氨基酸,属于Cullin蛋白家族。原位杂交结果表明,Bxy-cul-1基因在松材线虫各发育阶段均有表达,胚胎期全胚胎表达,2龄期广泛表达,3龄期和4龄期主要在肠道、体壁肌肉和尾部表达;成虫期,Bxy-cul-1基因在雌虫的卵母细胞和阴户、雄虫的腹部、交合刺和尾部表达。实时荧光定量PCR结果显示,Bxy-cul-1基因在松材线虫2龄期表达量最高,胚胎期次之,3龄期、4龄期、成虫期表达量依次递减。对松材线虫胚胎干扰后发... 相似文献
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采用SDS法提取线虫基因组DNA,分别选取了6种随机引物对部分地区的10株松材线虫和10株拟松材线虫进行随机扩增和亲缘关系比较。RAPD的结果可以明显区分松材线虫和拟松材线虫,与形态学分类相吻合。聚类分析的结果也表明,线虫种内和种间均存在差异,但种间差异明显大于种内差异,同种线虫在同一地区或临近地区的同源性明显高于其它地区,同一地区内寄主对线虫种类分布的影响较小。该方法具有所需样品量少、检测灵敏度高、结果准确等优点,为松材线虫种群的亲缘关系、传播途径及其检测防疫等方面提供一种灵敏、可靠的研究方法。 相似文献
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[目的]为了构建松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)果胶酶Bxpel2基因干扰载体.[方法]通过Trizol 法提取松材线虫总RNA,反转录合成cDNA,设计带T7启动子的果胶酶Bxpel2基因引物,以cDNA为模板扩增出果胶酶Bxpel2基因片段,连接到RNA干扰载体,再以干扰载体为模板,PCR扩增出目的片段后进行测序鉴定,合成果胶酶Bxpel2基因双链RNA(dsRNA),采用RT-PCR检测松材线虫Bxpel2基因干扰后的表达情况.[结果]表明:1)提取的松材线虫总RNA完整性好,无降解;2)成功克隆出松材线虫果胶酶Bxpel2基因片段(790 bp)并将其连接至pMD19-T载体;3)以RNA干扰载体为模板合成dsRNA,浓度分别为1.313 mg·mL-1和1.152 mg·mL-1;4)RT-PCR结果显示,松材线虫经过dsRNA干扰后,Bxpel2基因表达基本受到抑制.[结论]成功构建松材线虫果胶酶Bxpel2基因干扰载体,为进一步研究Bxpel2基因在松材线虫致病过程中的作用和功能奠定了良好的基础. 相似文献
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疫木中松材线虫的免疫学检测方法的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
以松材线虫的粉碎虫体免疫家兔制备抗血清 ,通过免疫印迹考察抗血清的特异性。利用固相松材线虫抗原和游离线虫抗原同线虫抗体相竞争 ,建立竞争型ELISA法用于疫木中松材线虫的分析。该方法可以直接检测出 10mg的木屑中 0 1μg微量的线虫蛋白 ,约 7条线虫的存在。利用该方法对 2 0个不同地区、树种及类型的松材样品进行检测 ,疫木中松材线虫的检出率为 10 0 % ,但拟松材线虫也呈现了一定的交叉反应。研究结果表明 ,以松材线虫抗原蛋白为指标的免疫学检测方法简便快速、灵敏度高 ,为松材线虫的快速检疫提供一种可能的途径 相似文献
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松材线虫CYP450基因与松树蒎烯类物质代谢的相关性 总被引：1，自引：0，他引：1
《林业科学》2017,(6)
【目的】通过比较松材线虫CYP450基因和寄主萜烯类物质代谢的时间特异性,研究松材线虫解毒相关CYP450基因与寄主蒎烯类物质代谢之间的相关性,为该病致病机制的深入研究提供基础。【方法】松材线虫接种5年生马尾松后,通过实时定量PCR研究松材线虫CYP450基因和寄主萜烯合成酶基因表达模式,同时通过气相色谱法检测寄主松树主要萜烯类物质代谢规律。【结果】松材线虫接种5年生马尾松后,松树蒎烯合成酶基因分别在第6天和第21天上调表达,而寄主松树体内α-蒎烯和β-蒎烯也具有2个峰值,分别在第9天和第27天时含量最高。松材线虫CYP-33C9基因在第12天和第15天大量表达,CYP-33C4基因在接种后第21天表达量最高。【结论】松材线虫的入侵引起松树蒎烯合成酶基因上调表达,生物合成大量蒎烯类物质,松材线虫CYP450基因响应松树蒎烯类物质的大量积累而上调表达。因此,根据松材线虫CYP450基因与松树蒎烯类物质代谢在时间上的相关性,推测CYP450基因可能参与了松材线虫蒎烯类物质代谢过程,可能是松材线虫致病相关基因之一。 相似文献
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7个杏李品种S基因型的鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为给杏李的品种配置和遗传育种提供了理论基础,利用特异性PCR扩增、DNA测序和生物信息学方法鉴定了恐龙蛋等7个杏李品种的S基因型.S基因的PCR扩增结果表明,Ph引物对风味皇后、味帝、味王、风味玫瑰、味厚、恐龙蛋6个品种扩增出1条850bp左右片段;Pe引物对风味皇后、味王、风味玫瑰、味厚、味馨5个品种扩增出1条1100bp左右片段;Pb引物对味帝和恐龙蛋扩增出900bp左右片段;P2引物对味馨扩增出850bp左右的片段.对PCR产物克隆后测序,并通过BLAST比对和生物信息学分析表明,风味皇后、味王、风味玫瑰和味厚4个品种的2个PCR产物分别与Se-RNase和Sh-RNase基因的相似性达100%,味帝和恐龙蛋的2个产物分别与Sb-RNase和Sh-RNase基因的相似性达100%,味馨的2个PCR产物与Se-RNase和S2-RNase基因的相似性达100%;结合PCR分析和序列生物信息学分析确定了味王等7个杏李品种的S基因型：风味皇后、味王、风味玫瑰和味厚等4个品种的S基因型相同,为SeSh;味帝和恐龙蛋的S基因型相同,为SbSh;味馨的S基因型为SeS2. 相似文献
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东亚型和欧洲型拟松材线虫的形态学和ITSPCR-RFLP鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
对宁波口岸截获的不同来源木质包装中的东亚型和欧洲型拟松材线虫进行形态学和ITSPCR-RFLP研究。选用5种限制性内切酶RsaI,HaeⅢ,MspI,HinfI,AluI对各株系单条线虫ITS区PCR扩增产物进行酶切,发现限制性内切酶RsaI有3种酶切结果,表明ITS区段存在DNA序列异质性。研究再次证明ITSPCR-RFLP不但是伞滑刃线虫鉴定十分可靠的辅助手段,还可有效区分种内不同地理型。对拟松材线虫与松材线虫(包括"M"型和"R"型株系)、豆伞滑刃线虫、伪伞滑刃线虫等近似种的区别进行讨论。 相似文献
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根据黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物对,运用单重RT-PCR检测到病毒并筛选出适合多重RT-PCR的引物对。以唐菖蒲18S rRNA为内参照,建立同时检测CMV和TMV的多重RT-PCR方法。此方法可从带病样品中扩增出CMV(629bp)和TMV(423bp)2条特异片段。测序结果表明:CMV扩增产物与其他植物分离物核苷酸的同源性为93%～97%,TMV扩增产物与其他分离物核苷酸的同源性可达99%。 相似文献