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为建立一种能快速检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的方法,根据GenBank中IBV的基因保守序列,设计一套环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,建立了IBV RT-LAMP可视化检测方法;该法对IBV RNA最小检测限为10 fg,而常规RT-PCR为1 pg,灵敏度高于常规PCR法100倍;对其他常见鸡病原体检测结果均为阴性;可通过肉眼观察颜色直接判定结果;本研究建立的IBV RT-LAMP方法简便、快捷、特异、灵敏,且只需1个可控温的水浴锅在1 h内即可完成全部反应,更适合基层业务部门及养殖场的检测,为IBV感染的快速检测提供新方法。 相似文献
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鸡传染性支气管炎病毒Real-time RT-PCR检测方法的建立及应用 总被引：1，自引：1，他引：0
为定量检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)载量,建立IBV的Real-time RT-PCR方法.用RT-PCR方法扩增出IBV的N基因片段,并克隆到pEASY-T3载体中,构建成含有N基因片段的重组质粒.应用该重组质粒进行SYBR Green I Real-time PCR,建立了定量检测IBV核酸的标准曲线与直线回归方程,该方法显示:特异性强,检测下限至少达到5.58× 102拷贝/μL,其重复性试验的变异系数小于3.2％;用建立的方法对实验接种IBV M41株的雏鸡组织中的病毒核酸进行了定量检测,检测结果显示:攻毒后肾脏中IBV含量高于支气管和肺脏,支气管和肺脏中病毒含量在攻毒后第3天高于攻毒后第7、10天,并证实临床表现与病毒载量之间存在密切关系.研究结果表明,建立的Real-time RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好,可用于IBV的定量检测. 相似文献
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为验证所引进9个血清型的非洲马瘟病毒,并同时对其分型鉴定方法有所探索,根据参考文献设计位于AHSV基因组L2片段的型特异性分型引物,用RT-PCR及测序方法进行实验研究。抽提所引进9种血清型的RNA,经RT-PCR扩增,各引物均有特异性扩增,经进一步的核苷酸序列测定及分析,证实所扩增片段均为非洲马瘟病毒L2基因相应位置片段;同时对AHSV分型RT-PCR检测方法进行了改进优化研究。实验证实分型引物对各RNA均有特异扩增,所引进9个血清型为正确血清型,并建立了适合实验室条件的AHSV分型鉴定方法。 相似文献
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猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联RT-PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：1，他引：1
摘要：参照国内外已发表的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）基因序列及其相关的RT-PCR检测方法,根据TGEV S蛋白基因和PEDV S基因各设计一套特异性通用引物,扩增目的带分别为426bp和584bp。通过对相关病毒检测,建立了TGEV和PEDV通用型二联RT-PCR检测方法。该方法具有快速、敏感、特异等优点,可为TGEV和PEDV的检测、流行病学调查及疫苗使用等奠定基础。 相似文献
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牛病毒性腹泻病毒RT—PCR检测方法研究 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】建立快速、简便、特异的检测牛病毒性腹泻病毒抗原的RT-PCR方法;【方法】根据已发表的牛病毒性腹泻病毒株(BVDV)5’端非编码区保守序列设计合成了两条引物,应用RT-PCR技术对两株BVDV标准株(OregonC24V and NADL)进行基因扩增,对扩增产物进行酶切鉴定。同时设猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK细胞作对照;【结果】两株BVDV标准株均扩增出了长度为325bp的片段,扩增产物经酶切后形成长度为111bp和214bp两条片段,而对猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK正常细胞扩增均为阴性,与预期结果一致。【结论】PCR检测方法可以快速准确地对牛病毒性腹泻-黏膜病作出诊断。该方法的敏感性可高达10-1TCID50。 相似文献
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《华北农学报》2017,(Z1)
利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法和RT-PCR方法建立2种有效地实验室检测牛病毒性腹泻病毒的方法。根据Gen Bank中登录的牛病毒性腹泻病毒基因序列,选取14株BVDVⅠ型和7株BVDVⅡ型,经序列比对后,设计合成1对特异性引物,建立了检测BVDV的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。通过对RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行检测。结果显示,该方法可从BVDV标准毒株Oregon C24V中扩增出250 bp的特异性片段,对牛细小病毒、牛副流感病毒、牛腺病毒、呼肠孤病毒的扩增结果均为阴性,对BVDV C24V株、GSTZ株、Av69株、S183株和BVDVⅡ型扩增结果为阳性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,RT-PCR的灵敏性为10-1TCID_(50)/mL,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的灵敏性为3.4×102copies/μL。应用2种方法对临床血清样本进行检测,结果比病毒分离方法更为敏感,操作简便。表明建立的RT-PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV的流行病学监测、实验室检测以及诊断。 相似文献
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【目的】建立快速、简便、特异的检测猪圆环病毒II型的PCR方法;【方法】根据已发表的猪圆环病毒II型基因序列设计合成了一对引物,用酚-氯仿法抽提可疑病料中的病毒DNA,应用PCR技术对猪圆环病毒进行基因扩增,PCR产物进行序列测定;以猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒为对照,进行特异性试验;取部分病料进行重复性试验;【结果】PCR方法扩增出了长度为702bp的片段,扩增产物经测序和序列分析表明扩增的序列为PCV2序列;猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的PCR扩增均为阴性,与预期结果一致;部分病料PCR重复检测5次,检测结果完全一致;【结论】PCR检测方法可以对猪圆环病毒病作出敏感、特异、准确地诊断,该方法检测的基因最低模板量为2×10-5 ng/ml 相似文献
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猪圆环病毒Ⅱ型PCR检测方法的研究 总被引：5，自引：0，他引：5
【目的】建立快速、简便、特异的检测猪圆环病毒II型的PCR方法;【方法】根据已发表的猪圆环病毒II型基因序列设计合成了一对引物,用酚-氯仿法抽提可疑病料中的病毒DNA,应用PCR技术对猪圆环病毒进行基因扩增,PCR产物进行序列测定;以猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒为对照,进行特异性试验;取部分病料进行重复性试验;【结果】PCR方法扩增出了长度为702bp的片段,扩增产物经测序和序列分析表明扩增的序列为PCV2序列;猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的PCR扩增均为阴性,与预期结果一致;部分病料PCR重复检测5次,检测结果完全一致;【结论】PCR检测方法可以对猪圆环病毒病作出敏感、特异、准确地诊断,该方法检测的基因最低模板量为2×10-5ng/ml。 相似文献
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猪流行性腹泻病毒Real-time PCR检测方法的建立 总被引：2，自引：1，他引：1
为定量检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）载量,建立PEDV的Real—timePCR方法。用RT-PCR方法扩增PEDV的M基因片段,构建含有M基因片段的重组质粒,用该重组质粒进行SYBRGreen I Real—timePCR,来建立检测PEDV的荧光定量PCR方法。结果显示：在（5．56×10^2-5．56×10^7）拷贝／皿范围内,所建立方法具有优良的线性关系,其决定系数为0．9996,扩增效率为99．5％,扩增产物的熔解曲线只有一个特异性峰,无引物二聚体峰,熔解温度为（81．18±0．21）℃。该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒II型等猪源病毒均检测不到扩增产物,重复性试验的变异系数小于3％,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明：建立的Real-timePCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏性高,可用于PEDV的定量检测及其早期感染的快速诊断。 相似文献
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应用PCR方法检测鸡传染性贫血病毒 总被引：1，自引：1，他引：1
根据鸡传染性贫血病毒(CIAV)基因组序列，设计一对引物扩增基因组上nt358～nt1042之间684bp DNA片段。在CIAV感染MDCC-MSBl细胞系中提取核酸为模板可扩增出相应DNA片段，且以感染细胞核酸为模板反应敏感性可达1fg，而以其他病原核酸为模板扩增结果均为阴性。应用该PCR方法对实验感染鸡肝脏、脾脏、胸腺、肾脏、法氏囊、骨髓、白细胞、泄殖腔棉拭子等不同样品进行检测，均可扩增出相应DNA片段。证明我们建立的PCR方法敏感性特异性强，可用于临床感染不同组织CIAV的检测。 相似文献
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鸡传染性法氏囊病病毒J1C7株全基因组的克隆与分子系统进化树分析 总被引：1，自引：1，他引：0
为了获得鸡传染性法氏囊病病毒J1C7株的全基因组cDNA,确定其分子进化关系。以IBDV J1C7株细胞培养液为材料,用蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提法提取IBDV基因组dsRNA,利用特异性引物将基因组A、B节段分两段进行RT-PCR并通过融合PCR方法将具有部分重叠序列的A、B节段的上、下游基因组进行拼接,从而构建出完整的A、B节段基因组,利用pMD-18T载体快速克隆PCR产物。结果表明：获得了3260 bp的A节段全长（Genbank登录号EF646854）和2827 bp的B节段全长（Genbank登录号EF646853）。氨基酸同源性比对结果表明：J1C7株与弱毒疫苗株CEF94（芬兰）、P2（德国）、JD1（中国）、HZ2（中国）的亲缘关系最近（蛋白同源性为VP5：99.3%;VP2：99.3%~100%;VP4：97.9%~99.2%;VP3：96.4%~98.1%;VP1：99.2%~99.9%）。BDV J1C7株属于弱毒疫苗株,且与欧洲和中国的弱毒疫苗株有密切的亲缘关系,在进化树上归为一簇。本研究为构建IBDV的感染性cDNA,了解IBDV基因组的结构与功能打下了基础。 相似文献
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为临床上能快速诊断虎流感,通过对已分离获得的虎源H5N1流感病毒和GenBank中报道的A型H5N1亚型流感病毒的NP、HA、NA序列,设计合成各个基因的特异性PCR扩增引物和A型流感病毒通用反转录引物。通过优化反应体系及条件,建立一步法可同时扩增出3个基因的联合RT-PCR检测方法。将该方法用于临床病料检测,并与电镜负染、HA/HI及病毒分离等方法进行比较。结果,NP、HA、NA基因的扩增片段大小分别为464bp、581bp、173bp,其检测的敏感性约100个TCID50。该方法的检出率和病毒分离结果相符,高于电镜负染和HA/HI试验。结果显示,该方法可用于虎源流感病毒的临床或实验室检测。 相似文献
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一株鸡传染性支气管炎病毒地方分离株膜蛋白基因的遗传变异分析 总被引：1，自引：0，他引：1
摘要：对从山西省分离到的1株IBV (IBVSX16)的膜蛋白基因片段进行序列测定及分析,结果发现, IBVSX16株膜蛋白基因含有一个长681bp的ORF,编码226个氨基酸残基组成的多肽,与疫苗株H120和我国分离株LX4推导的氨基酸序列比对发现,存在基因突变现象,未发现缺失和插入现象,变异主要发生在2~l7位。系统进化关系显示19株IBV毒株分属于5个群。IBVSX16株位于第II群,我国IBV分离毒株主要集中在第III群和第Ⅳ群,具有较明显的地理区域性,可见IBV分离株在基因进化关系上形成了自己较为独立的进化群。关键词：鸡传染性支气管炎病毒;M基因;遗传变异 相似文献
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应用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)接种﹑琼脂扩散试验、电镜观察,从临床病鸡的法氏囊组织分别分离到3株传染性法氏囊病病毒（IBDV）CH03、JG04和QJ04株,对4周龄未免疫鸡的攻毒致死率分别为92%、83%、67%,对鸡胚的半数致死量（ELD50）分别为10-6.8/0.2ml、10-5.4/0.2ml、10-4.6/0.2ml;应用逆转录酶-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增的IBDV VP2基因高变区（vVP2）及其序列分析的结果表明,序列共有492个核苷酸,编码164个氨基酸。关键位点的氨基酸变化特征：第一亲水区P222A、疏水区的K249Q和S254G、N279D和T284A,与超强毒参考株UK661﹑HK46﹑OKYM和CH1-97极为相似,而与致弱株Cu-1）及变异毒株Var-E存在明显差异。研究结果表明,获得的3株IBDV分离株均属超强毒株。 相似文献
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复合侵染甘蔗的病原病毒RT-PCR检测 总被引：1，自引：1，他引：0
根据甘蔗花叶病毒（sugarcane mosaic virus,SCMV）、高粱花叶病毒（sorghum mosaic virus,SrMV）和甘蔗黄叶病毒（sugarcane yellow leaf virus,SCYLV）外壳蛋白（CP）基因序列分别设计合成3对特异引物SCMV–F/R、SrMV-F/R和SCYLV-F/R,以表现花叶和黄叶复合症状的甘蔗叶片总RNA为模板,分别进行3种病毒单一RT-PCR检测,在SrMV和SCYLV特异引物RT-PCR反应体系中分别扩增到约850 bp和630 bp特异性片段。序列测定及同源性比对结果显示,850 bp片段测序所得序列与浙江象山、临平和余杭SrMV分离物（GenBank登录号分别为AJ310194、AJ310195和AJ310198）对应序列同源性95%,630 bp片段测序所得序列与广东、广西、福建SCYLV分离物（GenBank登录号分别为GU190165、GU190162、GU190159）对应序列同源性99%,表明该样品同时感染SrMV和SCYLV。在此基础上建立同时检测SrMV和SCYLV的一步双重RT-PCR体系,可检测10-6 g病叶组织中的病毒,田间样品检测效果良好。 相似文献
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禽用疫苗病毒浓缩技术的研究 总被引：4，自引：0，他引：4
采用FILTRON中型盒式超滤系统,分别选用截留分子量为30,50,100及300 K 4种不同孔径的超滤膜,对NDV,AIV,EDS76V,IBV及IBDV共5种病毒抗原液进行了浓缩试验研究。结果显示,这4种孔径的超滤膜均可用于上述5种病毒液的浓缩,其病毒的截留率可达99.9%~100%;采用各种病毒浓缩液、未浓缩病毒液及超滤液制成各种相应浓缩苗、未浓缩苗及超滤液乳剂免疫试验鸡。试验证明,浓缩苗明显优于未浓缩苗,在病毒浓缩过程中均未出现有效抗原成分的丢失,其抗原性也未发生变化。 相似文献