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1.
为了建立一种快速区分样品中沙门氏菌的死细菌与活细菌的检测方法,将叠氮溴化乙锭（EMA）与PCR技术相结合。以沙门氏茵的invA为靶基因,以沙门氏菌的纯培养细胞做模板进行扩增,并进行灵敏度、特异性、曝光时间及EMA浓度试验。结果显示,灵敏度为14CFU／mL,最佳曝光时间为2min,当EMA的浓度小于18μg／mL时．EMA对活菌靶基因的扩增没有明显的抑制,而终浓度为1μg／mL的EMA,能有效抑制lxlosCFU／mL沙门氏菌死菌的扩增。EMA—PCR能有效降低沙门氏菌检测过程中的假阳性。 相似文献
2.
为了建立1种快速检测样品中大肠杆菌O157并能区分死细菌与活细菌的检测方法,将叠氮溴化乙锭(EMA)与PCR结合,以O157特有的抗原基因rfbE为靶基因,以O157的纯培养物为模板扩增,进行灵敏度、特异性、曝光时间及最佳EMA浓度筛选实验。结果显示:该检测方法的灵敏度为1.2×102CFU/mL,最佳曝光时间为1 min。终浓度≥1μg/mL的EMA,能有效抑制O157死菌的扩增,而当EMA终浓度≤16μg/mL时对活菌靶基因的扩增没有明显的抑制作用。EMA-PCR能有效减少O157活菌检测过程中假阳性结果的出现。 相似文献
3.
《蚕业科学》2015,(5)
由青枯劳尔氏菌(以下简称青枯菌)5号生理小种(Ralstonia solanacearum race 5)引起的桑青枯病是桑树的重大病害。采用荧光定量PCR(qPCR)技术对病原菌进行早期检测,为病害的预测预报及有效防控提供依据。从青枯菌差减基因文库筛选一对引物RS72F/RS312R,经PCR扩增试验及qPCR产物的熔解曲线分析验证其可特异性地扩增出青枯菌5号生理小种241 bp的基因片段。建立的qPCR标准曲线显示:以青枯菌5号生理小种基因组DNA为模板,在10-4~102 ng/μL范围内,DNA质量浓度的对数值与扩增Ct值呈现良好的线性关系,线性方程为y=-2.747x+21.834,R2=0.993;以青枯菌5号生理小种菌液为模板,在103~107 CFU/mL范围内,菌液浓度的对数值与扩增Ct值呈现良好的线性关系,线性方程为y=-3.418x+45.447,R2=0.998。应用建立的qPCR检测方法对经青枯菌5号生理小种菌液处理的土壤样品进行检测,结果显示可检测出自然环境中存在的低于致病浓度的病原青枯菌,且用菌液处理灭菌土壤和不灭菌土壤的样品间青枯菌检测的Ct值无显著差异。建立的检测方法具有特异性强、灵敏度高、可定量的特点,适用于由青枯菌5号生理小种引起的桑青枯病的早期检测诊断 相似文献
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《蚕业科学》2015,(6)
青枯菌5号生理小种(Ralstonia solanacearum race 5)是引发桑青枯病的病原菌。为了改进常规PCR方法不能对活体病原菌进行准确鉴别和定量分析的不足,建立叠氮溴化丙锭(PMA)预处理结合荧光定量PCR(q PCR)检测青枯菌5号生理小种活菌的方法。该方法首先将待检测样品的病原菌细胞用质量浓度为15 ng/μL的PMA暗孵育10 min后,在卤钨灯下曝光5min,以消除死菌细胞DNA的PCR扩增信号。用PMA-q PCR方法对含青枯菌5号生理小种活菌和死菌的混合样本的检测结果表明,死菌的存在不会对活菌细胞DNA的扩增产生影响。建立的PMA-q PCR标准曲线显示,在菌液浓度为103~107CFU/m L的范围内,qPCR循环阈值(Ct)与菌液浓度的对数值之间呈良好的线性关系,线性方程为y=-3.477x+47.489,R~2=0.997。建立的PMA-q PCR方法能更为准确地检测复杂样本中的青枯菌5号生理小种活菌数量,有助于对桑树青枯病的早期诊断和及时制定病害防控措施。 相似文献
5.
为验证煮沸法提取细菌DNA在布鲁氏菌病原学检测中的可行性,将布鲁氏菌S2活疫苗稀释成不同活菌浓度,应用煮沸法提取样品DNA,经荧光定量PCR检测,扩增结果与预期一致,不同活菌浓度样品Ct值得到了很好区分。证实煮沸法可用于布鲁氏菌的病原学检测。 相似文献
6.
《中国预防兽医学报》2020,(4)
为简便、快速测定宿主体内或细胞内布鲁氏菌的活菌数,本研究以布鲁氏菌单拷贝bcsp31基因为检测靶标,设计特异性引物,经优化反应条件及叠氮溴化丙锭(PMA)最佳使用浓度与曝光时间,建立了一种测定布鲁氏菌活菌数的叠氮溴化丙锭--荧光定量PCR方法(PMA-qPCR),并评估了该方法的特异性、敏感性、重复性。结果显示,建立的qPCR标准曲线Ct值与质粒标准品拷贝数对数值之间线性关系良好;特异性试验结果显示,该方法对布鲁氏菌S2株扩增结果为阳性,对大肠杆菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶氏菌、副溶血弧菌扩增结果均为阴性;其对布鲁氏菌S2的检测限为10~3cfu/mL,比常规PCR方法敏感性高100倍;重复性试验结果显示,批间及批内重复试验的变异系数均为0.63%～2.04%,重复性好。利用该方法对不同比例布鲁氏菌S2活菌/死菌混合样品定量测定,结果显示随活菌比例的增大,测得的活菌数与常规qPCR测定值越接近,表明经优化处理的PMA有效抑制了qPCR对死菌DNA的扩增,但对活菌的qPCR扩增无影响。将该方法与平板计数法共同测定TSB纯培养的布鲁氏菌S2活菌数,结果二者的测定值无统计学差异。随后利用这两种方法同时测定两种不同浓度的S2侵染巨噬细胞后的胞内活菌数,结果显示两种方法测定值虽然均差异显著(p0.05),但测得的活菌数均在一个数量级且变化趋势一致,并均与侵染的活菌数呈正相关。上述结果表明,本研究建立的PMA-qPCR检测方法可以对布鲁氏菌活菌实现快速定量检测,为布鲁氏菌活菌数测定相关研究提供可行技术。 相似文献
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《现代畜牧兽医》2018,(11)
本试验旨在建立伪结核棒状杆菌的活菌检测方法,为临床检测及疫病防控提供理论依据。利用PMA可选择性穿透死菌细胞膜,在强光作用下与死菌DNA共价交联,阻止以其DNA为模板的PCR扩增这一原理,将PMA与PCR鉴定相结合,并对PMA最佳曝光时间、最适工作浓度进行优化,建立伪结核棒状杆菌PMA-PCR活菌检测方法,并对其特异性进行分析。结果表明最佳曝光时间为15 min,PMA能够完全抑制死菌PCR扩增的最低浓度为20μmol/L,不抑制活菌PCR扩增的最大PMA浓度为30μmol/L。特异性试验结果显示,仅伪结核棒状杆菌可扩增出目的条带,而在链球菌、多杀性巴氏杆菌中未扩增出目的条带。对不同比例的死/活菌检测发现,该方法可以有效针对活菌进行检测,活菌的最低检测浓度为1×104 cfu/mL。本研究为伪结核棒状杆菌的活菌检测提供了一定的理论依据,也为由伪结核棒状杆菌诱发的山羊疫病防控奠定了基础。 相似文献
8.
《中国畜牧兽医文摘》2012,(10)
根据沙门氏菌保守的侵袭蛋白A(invasion protein A,invA)基因序列设计特异性引物,对实验菌株进行PCR检测,结果只有沙门氏菌能扩增出大小为285bp的特异性条带,而其他对照菌株未扩增出条带。本研究利用EMA能穿过死细菌的细胞膜并在光激活的作用下能与基因组DNA共价结合,从而能抑制死菌DNA进行PCR扩增的特性,建立了一种快速、有效的检测沙门氏菌活菌的EMA-PCR方法,从而避免了因分析的样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果。该方法较传统PCR大大提高了检测的准确性和真实性,检测灵敏度可达11CFU/ml。 相似文献
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根据金黄色葡萄球菌(SA)耐热核酸酶编码基因(nuc基因)设计特异性引物,对试验菌株进行PCR检测,结果显示,金黄色葡萄球菌扩增出大小为480 bp的特异性条带,而其他对照菌株未扩增出条带.由于传统PCR技术无法区分样品中的死细菌与活细菌,从而使检测结果往往出现很高的假阳性.本试验利用EMA能穿过死细菌的细胞膜并在光激活的作用下能与基因组DNA共价结合,从而能抑制死菌DNA进行PCR扩增的特性,建立了一种快速、有效的检测金黄色葡萄球菌活菌的EMA-PCR方法,较传统PCR大大提高了检测的准确性和可靠性,该方法检测灵敏度可达15 CFU/mL. 相似文献
10.
本试验旨在建立一种乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法.优化qPCR检测方法,探究菌浓度为1×108 CFU/mL的大肠杆菌活菌悬液、热致死菌悬液细胞数来确定不同的PMA剂量、暗孵育时间、曝光时间对死菌抑制效果的影响,确定最佳PMA处理方案.结果表明,qPCR检测可特异性扩增大肠杆菌,1×108 CFU/mL的大肠杆菌经90 ℃水浴30 s全部致死后,采用10 μg/mL的 PMA暗孵育15 min后冰上曝光10 min为最佳处理方案,这种处理方案可最大程度抑制死细胞信号,而对活细胞几乎没有影响,样品中微生物初始浓度不低于1×108 CFU/mL时较稳定,得到标准曲线回归方程y=-3.356x+47.413,R2=0.9989,最低检测限为103 CFU/mL,加标样本检测结果与实际相符.该方法为利用PMA-qPCR检测食品中的活大肠杆菌杆菌奠定了基础. 相似文献
11.
由于传统PCR技术无法区分样品中的死细菌与活细菌,为避免因样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果,本研究根据肠毒性大肠埃希菌(ETEC)不耐热肠毒素LTa基因设计特异性引物,利用叠氮溴乙锭(EMA)处理菌液,沸水浴法制备细菌裂解液,优化PCR条件,建立一种检测肠毒性大肠埃希菌活菌肠毒素基因的EMA-PCR方法。肠毒性大肠埃希菌CVCC196、CVCC197、CVCC200均能扩增出大小为438bp的特异性条带,而其他对照菌株未扩增出条带。经EMA处理,除了完全死菌组外,含有10mL/L～1 000mL/L活菌的混合悬液均可扩增出目的片段。因此,成功建立了一种快速、有效的检测肠毒性大肠埃希菌活菌肠毒素基因的EMA-PCR方法,该方法较传统PCR大大提高了检测的准确性,灵敏度可达19cfu/mL。 相似文献
12.
《中国家禽》2017,(10)
试验旨在研究不同发酵时间对乳酸菌发酵饲料中主要营养物质、乳酸菌和乳酸含量的影响。利用植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵由玉米、菜籽粕、棉籽粕组成的混合饲料,发酵30 d,每隔5 d取样检测发酵饲料中的主要营养物质、乳酸菌和乳酸含量。结果:乳酸菌发酵饲料粗蛋白、氨基酸、赖氨酸、蛋氨酸、钙、非植酸磷、氯和钠等营养物质含量显著高于未发酵饲料(P0.05);发酵饲料总能和表观代谢能显著低于未发酵饲料(P0.05);发酵饲料乳酸菌数量和乳酸含量显著高于未发酵饲料(P0.05),随着发酵时间延长,乳酸菌数量呈明显下降趋势。发酵至第5天,发酵饲料粗蛋白、代谢能、乳酸菌数和乳酸含量分别为20.42%、6.19 MJ/kg、19.0×10~7g和137.15 mmol/kg,第10天分别为19.57%、6.13 MJ/kg、12.67×10~7g和147.29 mmol/kg。而且随着发酵时间的增加,饲料中粗蛋白、氨基酸、蛋氨酸、总能、代谢能、乳酸菌活菌数及乳酸均呈二次曲线关系。提示乳酸菌发酵饲料在发酵后5~10 d内使用比较适宜。 相似文献
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实时荧光定量PCR检测畜禽肉制品中鸭源性成分 总被引：3，自引：0，他引：3
根据鸭mtDNA COX基因上的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR用于检测畜禽肉制品中的鸭源性成分。结果表明,建立的方法特异性强,与鹅、鸡、羊、牛等15种动物DNA无非特异性扩增;灵敏度高,可检测1.0pg/μL鸭源DNA的存在;重复性好,同DNA浓度所测得Ct值的变异系数均小于3%;应用该法对模拟混合样品进行检测,结果与预期相符,且常见肉类DNA的存在并不影响该法对鸭源性成分检测的灵敏度。说明本试验建立的鸭源性成分实时荧光定量PCR法特异、敏感、稳定,可快速准确检测畜禽肉制品中含有的鸭源性成分。 相似文献
14.
试验旨在研究快速、简单、高效提取芽孢杆菌与乳酸菌DNA的方法。在微波炉额定功率800 W下,对芽孢杆菌和乳酸菌进行微波处理40~150 s,离心获取上清,收获细菌DNA,将样本DNA PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳验证,测定其纯度和产量后测序。结果显示,在微波炉功率800 W条件下加热40~150 s均可有效提取芽孢杆菌与乳酸菌DNA。所得DNA质量较好（D260 nm/D280 nm在1.8~2.1之间）。DNA浓度符合PCR检测要求,目的条带清晰,所得测序结果满足常规分子生物学研究。该微波提取方法具有简单、快速、高效的特点,且具有广泛的实用性,为乳酸菌与芽孢杆菌快速分子检测提供了简便手段。 相似文献
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本试验利用热灭活致死法、超声裂解致死法和紫外线照射法3种制备结核分支杆菌死菌悬液的方法,比较不同灭菌方法制备的死菌对PMA-qPCR偶联技术结果的影响,选择结核分支杆菌死菌悬液的最佳制备方法制备后续试验中用到的结核分支杆菌死菌;探索PMA-qPCR偶联技术的适用范围和局限性.结果表明,热灭活法和超声裂解致死法制备的结核分支杆菌死菌悬液影响PMA-qPCR检测的Ct值的变化;紫外线照射法制备的结核分支杆菌死菌悬液对PMA-qPCR检测的Ct值没有影响;热灭活法是制备结核分支杆菌死菌悬液的最佳方法;PMA-qPCR偶联技术不适用于细胞膜无损伤致死法制备死菌的检测. 相似文献
16.
《中国兽医杂志》2019,(7)
本试验根据虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)18S的保守序列设计4套环介导等温扩增(LAMP)引物,从中筛选出一套引物对LAMP反应体系(Bst DNA聚合酶浓度、内外引物浓度比、dNTP浓度、Mg~(2+)浓度)和反应条件(温度)进行优化。并对优化后的LAMP反应体系和条件进行特异性、灵敏度及精密度验证。特异性试验表明,该方法能特异性检测虾肝肠胞虫,而与其他病害的核酸没有交叉反应;灵敏度试验表明,可检测浓度为10 fg/μL的质粒DNA,制作的标准曲线可对虾肝肠胞虫进行定量分析。重复性试验结果表明,该方法Ct值的变异系数为2.88%～3.02%,具有良好的稳定性。而对于人工侵染的虾肝肠胞虫样品,LAMP方法可检测低至0.44 pg/μL。应用建立的LAMP方法对3个不同地区的120份凡纳滨对虾样品进行检测,检测结果表明,EHP阳性样品数为43,与qPCR检测结果符合率达97%。本试验所建立的LAMP方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,并能在30 min内完成样品的检测,是快速、定量检测虾肝肠胞虫的有效手段。 相似文献
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叠氮溴化丙锭（propidium monoazide,PMA）是一种光反应的DNA结合染料,具有极高的DNA亲和结合能力。PMA可进入死亡和外膜损伤严重的微生物内部,插入DNA结构中,经可见光刺激发生光裂解后,同DNA结合发生共价交联反应,共价交联产物可以抑制DNA的PCR扩增。基于PMA的这一特性,PMAPCR可用于鉴别活死细菌、真菌、病毒等微生物。在实际应用中,PMA-PCR检测结果受样本浊度、活死微生物比例、PMA浓度、暗处理条件（温度、暗处理时间）、曝光条件（光源、光处理时间）、样本处理方法以及目的基因扩增长度等多种因素影响。PMA-PCR已被应用于动植物疫病防控、食品安全、公共卫生等多个领域,具有广阔的应用前景。 相似文献
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根据GenBank上鸡的3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因的序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR Green Ⅰ染料建立了荧光定量PCR法.采用梯度浓度的GAPDH基因重组标准品质粒DNA进行荧光定量PCR并建立了标准曲线,经分析显示标准曲线的Ct值与标准品浓度的对数值之间存在良好的线性关系;动力学曲线分析表明,在本研究所建立的反应体系和反应条件下,标准曲线的灵敏度都达到10拷贝/反应.实时荧光定量PCR检测GAPDH基因表达水平标准品质粒和标准曲线的建立,为GAPDH基因作为内参基因进行鸡功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础. 相似文献