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在植物的不同生长、发育、繁殖阶段和不同类型细胞中,基因的表达各不相同。近几年发展起来的研究基因差异表达的方法很多,抑制消减杂交（Suppression Subtractive Hybridization）是其中一项基于转录水平,结合消减杂交与 PCR技术的分离差异表达基因的方法,其原理可概括为消减同源序列,富集差异序列。该技术报道于1996年,在一个循环过程中分离差异表达基因尤其是低丰度表达的基因,虽然存在一些缺点,但以其较高的灵敏性、容易操作、假阳性率低、重复性好等优点,在分离及其克隆差异表达基因研究方面得到了广泛的应用。近几年,此技术在植物抗病基因的诱导表达方面已得到了应用,目前大多数研究主要集中在文库构建及筛选等方面。文章对抑制性消减杂交（SSH）技术的原理、优缺点及其在植物抗病性研究机制中应用进展进行了综述。 相似文献
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总结了目前植物基因分离的方法及其成就 ,概括出 6种植物基因分离的方法 ,即序列克隆法、功能克隆法、转座子标签法、图谱分离法、消减杂交法和差异表达分析法 (c DNA- RAPD、DD- PCR、RDA和 SSH) ,并对其特点和适用范围进行了评述 . 相似文献
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抑制消减杂交( SSH)高灵敏、易操作、高效富集低表达丰度基因和均一化目的基因片断,广泛用于差异表达基因的分离和cDNA文库构建.在实验操作中常出现低表达mRNA和cDNA丢失、大片断连接效率低等问题,构建的文库质量差,文章通过改进萃取操作提高目的产物(mRNA和cDNA)回收率,回收率增加30％以上;通过采用PVPP、高浓度KAc专一性结合和LiC1沉淀等措施除去RNA中的多酚和多糖、进而增加可分离mRNA种类和含量,对应的Uni-EST种类增加近3倍,通过采用胶回收并分段连接保护大片断cDNA等措施使文库中转录本丰富度增加,大片段(500 bp以上)比例增大,cDNA平均长度增大,文库质量明显提高. 相似文献
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植物基因工程发展现状与展望 总被引：1，自引：0，他引：1
1 植物转基因方法的研究进展到目前为止 ,植物基因工程已经在很多方面有了深入的发展。包括 :目的基因的分离克隆 ,基因工程的克隆载体[1 ] ,转基因方法的研究[2 ,3] ,基因转移的表达 ,转基因作物的利弊探析[4～ 8] ,分子标记的方法 ,分子标记在作物品种资源和遗传育种中的应用等[9～ 1 1 ] 。迄今为止 ,用于植物外源基因的导入方法和技术很多 ,这些方法在不同的植物类型和组织中有着不同的适用范围和优缺点。1 .1 土壤农杆菌转化系统农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌 ,与植物基因转化有关的有两种类型 :一为根癌农杆菌 (Ａ ｇｒｏｂａｃｔ… 相似文献
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抑制消减杂交技术筛选鹅产蛋期差异表达基因 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]鉴定筛选鹅产蛋与就巢差异表达基因。[方法]应用抑制消减杂交技术构建鹅产蛋与就巢鹅卵巢组织双向cDNA文库,获得差异表达基因。[结果]从双向文库随机挑选单菌落进行PCR验证,结果表明文库质量良好。选取654个阳性克隆进行测序分析,获得641条表达序列标签（ESTs）。对ESTs进行去除载体序列、质量检测、聚类及拼接,经Blast比对,有166条ESTs找到与之匹配的同源序列,其中92个是功能基因。[结论]比较就巢与产蛋SSH文库,发现产蛋特异性基因文库中参与物质能量代谢、细胞防御的基因较多,而在就巢SSH库中参与细胞凋亡、信号转导及细胞结构的基因出现频率较高。该结果对进一步研究鹅卵泡发育及繁殖力分子标记筛选打下了基础。 相似文献
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[目的]以GFP基因为报告基因,构建HcGKR基因的亚细胞定位表达载体.[方法]采用PCR方法和基因枪法.[结果]用PCR法,以pGEM- T- HcGKR质粒为模板,获得HcGKR基因的目的片段.然后将其克隆到亚细胞定位表达载体35S:GFP中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的35S - GFP - HcGKR融合表达载体,使目的基因能够和GFP融合同时表达.采用基因枪法将35S - GFP - HcGKR转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h后,经共聚焦显微镜观察确定发出绿色荧光的位置,对HcGKR基因进行亚细胞定位.[结论]构建的亚细胞定位表达载体可在植物细胞中表达,通过洋葱细胞中绿色荧光的位置确定目的基因定位在细胞膜上,为进一步盐穗木HcGKR基因的功能奠定了理论基础. 相似文献
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从实验室建立的甘薯冷胁迫抑制消减文库中分离出一cDNA片段,经NCBI比对后发现该片段与其它植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因具有90%的同源性,根据相关物种S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因cDNA序列设计引物,以甘薯总RNA为模板,经RT-PCR扩增首次获得全长1182bp的甘薯SAMS完全编码区,NCBI比对分析结果表明:该片段与不同种属植物sams基因的编码区序列的核苷酸相似性达85.48%,所推导的氨基酸序列相似性达93.6%。根据核苷酸序列和氨基酸序列分别构建了SAMS系统进化树,从分子水平阐明了植物种属间的亲缘进化关系,为其种质资源利用提供理论依据。利用该序列与原核表达载体pET32a连接构建融合表达载体pET-SAMS,酶切鉴定后转入大肠杆菌BL21,在不同温度下诱导3h后均表达出一63KDa大小融合蛋白。 相似文献
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本研究以4℃(Tester)和20℃(Driver)处理的马铃薯野生种Solanum berthaultii的无性系CW2-1块茎为材料,构建马铃薯块茎低温反应抑制差减文库以进一步筛选差异表达基因。通过PCR鉴定后,获得了含有2 112个阳性克隆的差减杂交文库。采用反向Northern方法对差减文库进行筛选鉴定,得到274个含有显著表达差异基因（P/N>3）的阳性克隆。从274个克隆中挑选了53个克隆进行测序和同源比对分析,合并后获得29个代表不同基因的非重复序列片段,表明文库具有较高质量。并随机选取了其中4个EST进行基因表达分析,结果显示,在耐低温糖化的S. berthaultii块茎中,4℃下贮藏的块茎基因表达强度高于20℃贮藏的块茎;同在4℃贮藏条件下,S. berthaultii和易低温糖化栽培种E1的块茎中基因的表达量亦存在差异,证明所构建的差减文库富集了马铃薯块茎对低温响应的基因。 相似文献
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以缩减杂交的原理和SMART cDNA合成方法为基础,开发了一种全长cDNA缩减杂交方法.该方法从微量的2个RNA样品合成全长cDNA,经PCR扩增和在两端连接不同的接头,通过2次缩减杂交获得含有高度浓缩的差异表达的全长或较大的基因片段,克隆后筛选出差异表达的基因.以噻菌灵(Probenazole,PBZ)为诱导剂处理水稻,获得了2个上调表达和1个下调表达基因的较长的cDNA片段. 相似文献
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受PVY诱导的烟草天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp的克隆与分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】通过筛选并克隆烟草抗马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)相关基因,分析其在不同诱导时间的相对表达量,揭示烟草抗病毒诱导的分子机理,以期为烟草抗病毒病育种奠定基础。【方法】通过抑制差减杂交和cDNA芯片从PVY诱导的抑制差减杂交文库中筛选上调表达(Ratio2)的基因中间片段,用RACE技术克隆其cDNA全长,并利用实时荧光定量PCR分析其在不同诱导时期的相对表达量。【结果】从受PVY诱导的烟草叶片中筛选一条595bp的基因中间片段并克隆得到一个全长为1770bp的天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp(GenBank登录号为GU144571),该基因编码506个氨基酸。多序列比对结果显示,该基因的编码产物与其它植物天冬氨酸蛋白酶家族成员具有高度的同源性,具有植物天冬氨酸蛋白酶典型的结构特征。实时荧光定量PCR分析表明,Ntasp在PVY接种早期上调表达。【结论】克隆得到一个烟草天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp,其表达受PVY侵染诱导。 相似文献
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北京鸭×番鸭杂种优势相关基因表达差异研究 总被引：3，自引：0，他引：3
用抑制性消减杂交(SSH)方法研究动物杂种相关基因表达差异。选用北京鸭、法国番鸭及其正反交F_1代,以杂种组为处理,亲本组为对照,建立肌肉组织SSH基因文库,随机选取1 000个单克隆测序,并与GenBank序列进行比对分析。结果共发现40个新ESTs,93个未知功能蛋白基因,34个已知功能蛋白基因。在34个已知功能蛋白基因中,杂种表达上调的基因有23个,杂种表达下调的有11个。研究表明杂种优势分子遗传基础复杂,涉及能量代谢、信号传导及调控、转录调控、蛋白质合成加工等基因的差异表达。 相似文献
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白桦为雌雄同株的单性花树种,在木本植物花发育研究中有着重要作用。本文旨在初步确定白桦雌花发育过程中的关键时期大孢子发生(前期)和配子体发育(中期)过程中基因表达及调控的差异,同时挖掘与雌花发育相关的基因。首先,运用细胞学方法确定试材雌花的发育时期。其次,采用抑制消减杂交(SSH)技术,分别以白桦前期和中期雌花序的cDNA作为tester和driver,建立正、反向抑制消减杂交cDNA文库:BHHQ和BHHZ。共获得1406个高质量的EST序列,其中787个与数据库中的已知核酸或蛋白序列有较高同源性, 47个可能与花发育相关。GO分析结果表明,这些基因34.96%参与生物合成,16.45%参与细胞组件,48.59%参与分子功能。另外,选择6个与花发育相关EST进行qRT-PCR分析,结果显示这些基因在不同组织中都有一定表达。其中bhhq.408,bhhq.435,bhhz.359,bhhz.215在生殖器官中的表达明显高于营养器官;bhhq.254,bhhq.190在绝大多数组织中均有一定表达,说明这些基因不仅参与生殖器官的发育,也在营养器官中发挥一定的作用。 相似文献