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甘肃金鳟是我国自主培育的虹鳟新品种,为进行其种质资源研究和遗传管理,以其尾鳍为试验材料,提取基因组DNA,对影响甘肃金鳟扩增片断长度多态性(AFLP)反应体系进行优化,包括模板DNA浓度、基因组酶切时间、选择性扩增中Mg2+、预扩增产物稀释倍数及选扩性引物M+3/E+3配比等进行比较分析,建立了适于甘肃金鳟的AFLP反应体系。即：100 ng 基因组DNA,3 U EcoR I 37℃酶切3 h,再 Mse I 65℃酶切5 h;然后用1 U的T4连接酶连接12 h, 选扩25 μl PCR反应体系中Mg2+2.0 mmol/L,预扩产物稀释30倍,选扩引物M+3/E+3配比为8∶1,所得产物经电泳和银染后可获得清晰条带,效果良好;筛选出了适宜甘肃金鳟品种分析的13对选择性引物。 相似文献
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本研究以大麻嫩叶为材料,以改进的SDS法,提取了高质量的大麻基因组DNA,经过酶切、连接、预扩增、选择性扩增、银染等试验条件的优化,建立了AFLP反应体系。研究结果表明:在常规的SDS提取液里加入8μL/mLβ-巯基乙醇(V/V)和3%PVP(M/V)能够提取到高质量的适用于AFLP的基因组DNA;选取150ng大麻基因组DNA来进行酶切,EcoRⅠ和MseⅠ各0.5U,在37℃酶切4h,即可完全酶切。最优的选择性扩增体系为20μL反应体系中含有1.0U Taq DNA polymerase、1.0μL25mmol/L Mg2+、0.4μL10mmol/LdNTPs、50ng/μL引物各1.0μL、4.0μL稀释50倍的预扩增产物及2μL10×PCR Buffer;使用该方法,获得了清晰、稳定的图谱并筛选到了18对多态性较好的AFLP引物组合。 相似文献
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以鲤科鱼类建鲤为材料,对扩增片断长度多态性(AFLP)反应体系进行优化,建立适合于鲤鱼的AFLP反应体系。通过对AFLP常规流程中基因组DNA提取、酶切-连接、预扩、选扩及电泳-银染过程的优化,初步建立了适合鲤鱼的AFLP分析体系：采用鲤血细胞DNA提取;MseI和 EcoRI37℃双酶切5h;预扩引物为E+A和M+C;选扩引物E+3与M+3浓度配比为1：8,为提高引物与模板的结合效率,选扩程序均采用touch-down程序;最后结合经典AgNO3-Na2CO3银染显色。通过优化的AFLP程序,本实验室从64对引物中筛选出8对多态性引物,为进一步的鲤鱼种质资源研究奠定基础。 相似文献
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大白菜基因组DNA的提取及AFLP反应体系的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
以大白菜嫩叶为材料,利用改进的CTAB法,提取到高质量的大白菜叶片总DNA,通过优化酶切、连接、预扩增、选择性扩增等试验条件,建立了大白菜AFLP银染反应体系,得到了清晰的大白菜AFLP指纹图谱为大白菜品种的分子标记和大白菜品种间亲缘关系等研究奠定了基础.研究结果表明:(1)DNA模板的质量影响酶切以及后续的连接扩增反应,改良的CTAB提取法可用于大白菜AFLP分析,形成清晰的AFLP指纹.(2)大白菜基因组DNA最佳酶切反应体系为:模板DNA总量150ng,反应体积为12.5μL,EcoR I 1.25 U,Mse I 1.25U,5xReaction Buffer,最佳酶切时间为:37℃酶切4h.连接反应于20℃连接2.5h即达最佳效果.(3)6对引物组合(E-AAC/M-CAG、E-AAG/M-CAC、E-ACA/M-CTG、E-ACT/M-CAC、E-ACT/M-CTT、E-ACT/M-CTC)均获得稳定、清晰的扩增图谱,可进行中国大白菜的遗传变异分析. 相似文献
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葎草DNA的提取及AFLP标记反应体系的建立 总被引：3，自引：0，他引：3
本文对CTAB法、改良CTAB法和SDS法提取雌雄异株植物葎草(Humulus scandens L.)基因组的方法进行了比较分析,并在此基础上对影响葎草AFLP扩增的关键因素模板浓度、酶切时间、选择性扩增模板浓度进行了优化.结果表明,改良的CTAB法更适合葎草基因组DNA的提取;同时利用AFLP分子标记技术,采用EcoI-Mse I酶切组合,共筛选27对引物组合,确定了适用于葎草AFLP反应的最佳酶切连接、预扩和选扩体系.同时发现2对引物组合E-ACG M-CTA和E-AAC M-CAC共扩增出5条雌雄性别特异条带. 相似文献
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马铃薯种质遗传多样性分析的AFLP反应体系优化与引物筛选 总被引：3，自引：0，他引：3
本试验主要对AFLP反应体系进行优化,并用该体系筛选适用于马铃薯种质资源遗传多样性分析的引物。酶切连接、预扩增和选择性扩增体系的优化结果表明,建立的马铃薯AFLP反应体系为:模板DNA160ng,37℃酶切连接12h;预扩增体系中dNTP浓度为0.2mmol/L,TaqDNA聚合酶用量为1U;选择性扩增体系中预扩增产物稀释20倍,引物终浓度为2.5ng/μL。利用优化后的AFLP反应体系,以5个马铃薯品种为试材筛选选择性引物,可以从81对引物组合中选出16对条带丰富且多态性较高的引物组合。本研究为种质资源鉴定、马铃薯遗传多样性以及马铃薯抗病性研究等奠定了良好的基础。 相似文献
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禾本科作物基因组AFLP分析体系的建立及优化 总被引：3，自引：0，他引：3
以禾本科作物小麦为出发材料,通过优化AFLP选择性扩增步骤的4个限制性因素:Mg2 浓度、dNTP浓度、引物浓度和预扩产物稀释倍数,确立AFLP最佳反应体系为:预扩增产物稀释20倍吸取2μL做为选择性扩增模板,混合1.5 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTPs,0.4μmol/L选扩引物1、U Ex Taq进行选择性扩增。应用该体系分析水稻和玉米两大类禾本科作物基因组DNA样品,同样取得理想结果,扩增出清晰可辨且适量的电泳条带。该技术体系为AFLP分子标记技术在禾本科作物遗传分析中的广泛应用奠定了基础。 相似文献
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《分子植物育种》2016,(1)
对AFLP实验流程中的基因组提取、酶切等关键因素进行优化,建立了芒属植物的AFLP(扩增片段长度多态性)分析体系。本研究分别采用常规CTAB法和改良的CTAB法提取芒属植物基因组DNA,基因组分别用HindⅢ/MseⅠ系统和PstⅠ/MseⅠ系统进行酶切和连接一步反应,连接产物稀释20倍后进行预扩增,预扩产物稀释20倍后进行选择性扩增。结果显示:采用改良CTAB法提取的DNA质量优于常规CTAB法;采用PstⅠ/MseⅠ系统酶切的DNA多态性高于HindⅢ/MseⅠ系统。采用优化后的AFLP体系分析30份供试芒属植物材料,从64对引物中筛选出8对多态性较好的AFLP选择性扩增引物,多态性比率达到100%,表明优化后的AFLP体系适合于芒属植物的分子标记分析,为芒属植物种质遗传多样性的分子研究奠定了技术基础。 相似文献
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为了构建一套适合中国独脚金种质资源的AFLP反应体系,本研究以独脚金幼嫩茎叶为材料,对影响AFLP反应体系的酶切连接反应、预扩增和选择性扩增过程中的一些关键因素进行优化,并利用优化的反应体系对AFLP引物进行筛选。结果表明,最佳的酶切反应体系为DNA模板200 ng,MseⅠ/EcoRⅠ用量3 U,总体积20μL,37℃酶切反应时间3 h,72℃灭活20 min;最佳连接反应体系为T4连接酶5 U,16℃连接过夜;最佳预扩增反应体系为dNTP浓度0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶浓度2 U,总体积25μL;选择性扩增的反应体系为d NTP浓度0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶浓度1 U,预扩增产物稀释5～10倍,总体积10μL。采用优化的AFLP反应体系,对来自3个不同来源地的独脚金样本进行选择性扩增,100对引物组合均能扩增出清晰、丰富的条带,且在参试样本中均能表现出一定的扩增多态性。本研究筛选出的引物组合可用于后续独脚金种质资源遗传多样性的研究,为独脚金遗传多样性研究、种质资源保存和鉴定提供一定的参考。 相似文献