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1.
酒类酒球菌mle基因座的克隆和测序 总被引：1，自引：1，他引：1
酒类酒球菌（Oenococcus oeni）是优良的葡萄酒乳酸菌。苹果酸-乳酸酶（malolactic enzyme，MLE）和苹果酸通透酶（malate permease，MleP）是苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF）的关键酶（Labarre et al.，1996）。酒类酒球菌mle基因座上的苹果酸-乳酸酶基因（mleA）和苹果酸通透酶基因（mleP）构成双顺反子的操纵子结构（Labarre et al．,1996）。本研究将我国自行筛选的酒类酒球菌优良菌系作为目的基因供体，进行mle基因座的克隆和其上2个基因的测序，为这2个基因的研究、利用及外源表达提供基本资料。 相似文献
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Oenococcus oenj苹果酸-乳酸发酵关键酶基因在酿酒酵母中的转化与表达 总被引：2，自引：0，他引：2
利用西北农林科技大学葡萄酒学院筛选出的酒酒球菌(Oenococcusoeni)优良菌系SD-2a的包含苹果酸-乳酸酶基因(mleA)和苹果酸通透酶基因(mleP)约2.6kb的基因片段,并以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件,以酵母-大肠杆菌穿梭质粒YEp352为载体,构建了重组表达质粒pYELmleAP,转化酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YS58,筛选获得酵母转化子YS58/pYELmleAP。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中,SDS-PAGE检测表明获得的转化子表达了苹果酸-乳酸酶的目的蛋白。对酵母转化子培养上清进行HPLC检测,采用t检验差异显著性分析,结果表明mleA基因在受体菌中进行了功能性表达。获得的酵母转化子在添加L-苹果酸的SD/-Ura培养基中培养4d,培养液中的L-苹果酸含量降低,培养液上清中L-苹果酸的剩余含量比空载体转化子极显著降低,苹果酸降低19.33%～19.42%。对照未检出乳酸的生成,供试的转化子L-乳酸生成量为1249～1368mg/L,与对照差异显著。 相似文献
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利用西北农林科技大学葡萄酒学院筛选出的酒酒球菌(Oenococcus oeni )优良菌系SD-2a的包含苹果酸-乳酸酶基因(mleA)和苹果酸通透酶基因(mleP )约2.6 kb的基因片段，并以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件，以酵母-大肠杆菌穿梭质粒YEp352为载体，构建了重组表达质粒pYELmleAP，转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS58，筛选获得酵母转化子YS58/pYELmleAP。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中，SDS-PAGE检测表明获得的转化子表达了苹果酸-乳酸酶的目的蛋白。对酵母转化子培养上清进行HPLC检测，采用t检验差异显著性分析，结果表明mleA基因在受体菌中进行了功能性表达。获得的酵母转化子在添加L-苹果酸的SD/-Ura培养基中培养4 d，培养液中的L-苹果酸含量降低，培养液上清中L-苹果酸的剩余含量比空载体转化子极显著降低，苹果酸降低19.33%～19.42%。对照未检出乳酸的生成，供试的转化子L-乳酸生成量为1249～1368 mg/L，与对照差异显著。 相似文献
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番茄果实中NEVER—RIPE基因的克隆及其反义表达载体的构建 总被引：6，自引：0，他引：6
从粉红期番茄果实中提取总RNA，根据Genebank中NEVER－RIPE（即NR基因）cDNA序列，设计合成特异性引物，用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）进行cDNA扩增，获得一个715bp左右的扩增产物，克隆于pGEM-T easy载体，测序确定其正确性。将该扩增产物反向克隆到植物表达载体pBI121中，通过PCR及限制性内切酶酶切鉴定重组质粒。将重组表达质粒导入根癌农杆菌LBA4404中，PCR及限制性内切酶酶切确定质粒已被导入。 相似文献
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本文通过PCR技术获得3D基因,使用拼接重叠延伸聚合酶链反应对3D基因内部的EcoRⅠ位点进行定点突变,将突变后的3D基因克隆至原核表达质粒pSOC和T4噬菌体的穿梭质粒pR中,通过PCR及质粒酶切鉴定,分别获得阳性重组子pSOC-3D和pR-3D。将含有3D基因的重组质粒pSOC-3D质粒转化大肠杆菌BL21进行表达,SDS-PAGE检测表达产物。将含有3D基因的重组质粒pR-3D转化T4噬菌体的宿主菌E2,通过同源重组获得重组噬菌体T4-3D,经SDS-PAGE及Western- blot检测,证明展示在T4噬菌体表面的3D融合蛋白能与FMDV感染血清发生特异性反应。 相似文献
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植物激活蛋白Ap36在苏云金芽胞杆菌的表达及抗病作用 总被引：1，自引：0，他引：1
以含有植物激活蛋白(Activator protein)基因ap36的质粒pMYE为摸板,设计一对特异引物,通过PCR反应扩增出激活蛋白基因开放读码框序列,使用XbaI和SphI双切PCR产物,插入到用这两酶双切的pBMB982-304质粒slh motif的下游,构建重组表达质粒pBMB0588,转化苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171。结果表明,目标蛋白以融合蛋白的形式成功表达。为探讨表达植物激活蛋白的重组菌是否能够诱导植物获得抗性,用重组菌在28℃培养24小时发酵液原液处理番茄幼苗和土豆片。结果显示,发酵液处理90min后,番茄叶片过氧化物酶(POD)和脯氨酸含量较对照分别提高了57.14%和131.59%;4d后苯丙氨酸解氨酶(PAL)含量较对照也有所提高;经重组菌发酵液处理的马铃薯片,对马铃薯软腐病表现出很强的抗病性。 相似文献
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利用PCR介导的基因置换技术构建阿维链霉菌bkdF-突变株 总被引：3，自引：1，他引：2
PCR介导的基因置换技术是一种利用λ噬菌体Red重组系统在微生物中进行基因中断的新方法。实验利用该方法快速构建基因中断载体，并成功地置换了阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）bkdF基因。先合成1对长度分别为58和59nt的引物，其5’端的39nt序列分别与bkdF基因两侧同源，3’端则分别与安普霉素抗性标记盒（aac（3）Ⅳ＋onT）两侧序列一致。以该引物扩增的PCR产物电转化能表达λRed重组酶且含有目标质粒的大肠杆菌（Eschcrichia．coli）菌株BW25113／pU790／pXW1224，获得了阳性重组质粒pXW1230。将该质粒中的大小为4．0kbBglⅡ目的片段插入基因置换载体pHZl35l，再接合转移至阿维链霉菌BJBM9903，筛选得到表型为Apma^RThio^S的接合子。PCR验证并对发酵产物进行HPLC和MS分析，证实该接合子为敞dkdF^-突变株。 相似文献
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参照GenBank中小反刍兽疫病毒((Peste des petits ruminants virus,PPRV)N基因序列（Nigeria/75/1）(1 578 bp)设计了1对添加EcoRⅠ和Not Ⅰ酶切位点的引物,对从奥地利引进的pCI-neo-PPRN质粒进行PCR扩增,克隆至pGM-T载体,并转化大肠杆菌Escherichia. coli TOP10感受态细胞,获得重组质粒pGM-T-PPRN。将重组质粒经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的产物插入原核表达载体pET-32a（+）,构建原核表达质粒pET-PPRN,将其转化进BL21(DE3)感受态细胞中后用IPTG诱导表达, 收集菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析,结果表明小反刍兽疫病毒N基因在BL21(DE3) 成功表达。所表达融合蛋白的相对分子质量约为80 kD,并能被组氨酸单抗、PPRV标准阳性羊血清及PPRV疫苗免疫羊血清所识别。 相似文献