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1.
本研究采用RT-PCR方法从培养的鹅外周血淋巴细胞总RNA中成功扩增到鹅IFN-γ基因。将克隆在pMD18-T载体中的鹅IFN-γ基因插入原核表达载体pGEX-6P-1,得到重组质粒pGEX-6P-1-IFN-γ。重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后作SDS-PAGE分析,得到约43 ku融合表达蛋白特异条带。用GST亲和纯化柱对原核表达产物中目的蛋白进行纯化,得到1.2 mg/L的纯化蛋白。用100TCID50病毒量在鹅副黏病毒(GPMV)/鹅胚成纤维细胞系统上测定表达蛋白的抗病毒活性,观察不同处理组的细胞形态并用RT-PCR方法鉴定,发现表达蛋白稀释倍数小于104可抑制GPMV复制,按照Reed-Muench法计算表达的鹅IFN-γ抗病毒效价为2.0×103U/mL,表明表达蛋白具有良好的抗病毒活性。 相似文献
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《动物医学进展》2015,(7)
为了表达猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白,并对其反应原性进行研究,采用RT-PCR方法扩增猪戊型肝炎病毒(SHEV)ORF3完整基因,将扩增产物插入pMD19-T载体,再亚克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建了pET-32a(+)-ORF3表达载体,转入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,同时对诱导表达条件进行筛选,并用SDS-PAGE和免疫印迹等方法分析鉴定表达产物。结果表明,成功扩增到345bp的目的基因片段,表达载体pET-32a(+)-ORF3转入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导,成功表达了ORF3基因编码的蛋白,当IPTG浓度为1mmol/L,诱导时间为6h时,该基因在E.coli BL21(DE3)中表达量最高。表达产物的分子质量约为29.6ku,与预期目的蛋白分子质量相符。表达的蛋白既有包涵体形式,也有可溶性形式。经Western blot检测,表达的目的蛋白能与SHEV阳性血清发生特异性反应。 相似文献
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《中国兽医学报》2019,(8):1506-1512
通过PCR扩增裂谷热病毒(RVFV) Gn蛋白胞外区(eGn)基因,连入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-RVFV-eGn。将重组质粒转化至感受态BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经HisTrap~(TM)FF蛋白纯化柱纯化目的蛋白。将目的蛋白免疫BALB/c小鼠,分离小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,免疫荧光鉴定制备的单克隆抗体特性。结果显示,PCR扩增出1 287 bp的目的基因;构建的重组质粒转化BL21细胞后可有效表达目的蛋白,确定最佳表达条件为30℃,0.8 mmol/L IPTG诱导5 h,目的蛋白以包涵体形式表达;纯化后目的蛋白纯度为94.136%;制备的单克隆抗体可特异性识别哺乳动物细胞表达的Gn蛋白,表明RVFV eGn蛋白具有良好的免疫原性。研究结果为裂谷热新型疫苗和快速诊断试剂的研制奠定基础。 相似文献
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本试验旨在利用大肠杆菌BL21(DE3)表达MxA融合蛋白pET32a(+)-MxA,制备兔抗人MxA抗血清。采用PCR技术获得MxA基因,然后将MxA基因重组到pET32a(+)载体中,筛选阳性克隆,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,用超声波裂解重组菌BL21(DE3)培养物,纯化蛋白质后免疫新西兰兔制备抗血清。SDS-PAGE分析结果显示,pET32a(+)-MxA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以包涵体形式高效表达;获得的抗血清经间接ELISA法检测效价为1∶6400;Western blotting检测结果显示,抗血清可与真核表达的MxA蛋白进行特异性结合。试验结果表明,在大肠杆菌中成功表达了pET32a(+)-MxA融合蛋白,制备了具有高度特异性的兔抗人MxA抗血清,这样为采用酶标法测定病毒患者全血细胞或由干扰素诱导的细胞产生的MxA蛋白质含量及临床诊断试剂盒的开发和应用打下了基础。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2020,(10)
为了实现H9N2亚型禽流感病毒的HA基因在原核系统中高效表达,试验参考GenBank发布的禽流感病毒A/chicken/Gansu/2/99(H9N2) HA基因序列(登录号为EF070733.1),优化该密码子,化学合成HA基因,并将该基因连接至pET-28a(+)质粒载体中,构建pET-28a(+)-HA重组质粒,转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)后诱导表达,并优化诱导温度(16,25,30,37℃)、IPTG诱导浓度(0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mmol/L)及诱导时间(2,4,6,8,10 h),用His-tag镍柱亲和层析纯化HA蛋白,并对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot鉴定。结果表明:成功构建重组基因工程菌pET-28a(+)-HA/BL21(DE3),其在30℃条件下,添加IPTG终浓度为0.8 mmol/L,诱导6 h时,HA重组蛋白表达量最佳。经His-tag镍柱纯化后在预期的63 ku处出现蛋白印迹条带。说明HA蛋白在大肠杆菌中成功表达。 相似文献
7.
为获得大量的猪瘟病毒重组蛋白抗原,本文构建了猪瘟兔化弱毒株E2蛋白ABCD抗原结构域原核重组表达质粒pET-32a(+)-ABCD,对该重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中的表达产量进行了比较分析,并采用胶体金免疫层析和蛋白质免疫印迹鉴定重组蛋白的反应原性。结果表明重组质粒pET-32a(+)-ABCD在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosseta(DE3)中均可以获得可溶性表达,目的蛋白表达量分别占总蛋白量的比例为11.4%和19.7%,大肠杆菌Rosseta(DE3)作为表达宿主菌更高效,且重组蛋白具有反应原性。该研究为猪瘟病毒重组蛋白抗原的制备提供了参考。 相似文献
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旨在利用GST pull-down技术验证新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基质(matrix,M)蛋白与鸡importinβ1蛋白在体外的相互作用。根据NDV ZJ1株M基因和鸡importinβ1基因序列设计引物,通过PCR扩增获得NDV M基因和鸡importinβ1基因,将其分别定向插入到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a(+)构建重组原核表达载体pGEX-6p-M、pET-32a-importinβ1,然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达,SDSPAGE检测重组蛋白的表达情况,并对包涵体重组蛋白进行变性和复性处理。然后以GST-M重组蛋白为诱饵蛋白,His-importinβ1重组蛋白为猎物蛋白,利用GST pull-down技术验证M蛋白与importinβ1蛋白的相互作用。结果表明,成功构建了重组原核表达载体pGEX-6p-M和pET-32a-importinβ1,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得了正确表达。SDS-PAGE电泳检测显示GST-M重组蛋白主要以包涵体形式存在,而His-importinβ1重组蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在。利用蛋白重折叠试剂盒获得了有活性的GST-M重组蛋白,将其作为诱饵蛋白,可以捕获并检测到His-importinβ1重组蛋白,但是GST标签蛋白不能结合His-importinβ1重组蛋白。利用GST pull-down技术证实了NDV M蛋白与鸡importinβ1蛋白在体外具有直接的相互作用,这为深入研究importinβ1蛋白在NDV M蛋白细胞核定位的分子机制以及在NDV复制和致病中的作用奠定了基础。 相似文献
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将含有山羊白细胞介素(gIL)-18基因的重组质粒pET-32a(+)在大肠杆菌BL21(DE3)中以1 mmol/L IPTG诱导4 h以上进行表达,SDS-PAGE试验检测到了gIL-18与pET载体融合表达的重组蛋白。以该重组蛋白与佐剂混合后,免疫小鼠制备多克隆抗血清,经Western blotting试验证实该重组蛋白具有免疫原性。经过包涵体变性、层析柱纯化和复性,证实该蛋白具有诱导MDBK细胞分泌IFN-γ和刺激PBMC增殖的生物学活性。这表明重组蛋白保留了天然蛋白大部分的生物学活性。另外发现,该重组蛋白还可以保护小鼠抵御PRV强毒的攻击。这为阐明重组gIL-18的活性以及作为免疫佐剂和免疫治疗剂的实际应用奠定了基础。 相似文献
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将重组有北京鸭抑制素α-亚基基因的T载体和pET-28a表达载体分别用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接并转化E. coli BL21(DE3),经PCR和双酶切鉴定,筛选得到阳性重组表达载体,在IPTG诱导下融合表达了北京鸭抑制素α-亚基蛋白。试验结果表明,抑制素α-亚基基因在E. coli BL21中得到了有效表达,表达产物具有免疫活性,为后期探讨该免疫原提高北京鸭产蛋性能的研究奠定基础。 相似文献
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《中国畜牧兽医》2016,(10)
根据GenBank中公布的犬α-干扰素(CaIFN-α)基因核酸序列,去掉信号肽后设计并合成1对引物,引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点。以提取的犬肝脏DNA为模板,利用PCR技术扩增CaIFN-α基因,并分别克隆至表达载体pBV220、pET-32a(His标签)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)原核表达系统。重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blotting鉴定。纯化目的蛋白,并采用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测其抗病毒活性。试验结果表明,与pBV220载体连接的目的基因表达的蛋白活性较低,而与pET-32a(His标签)连接的目的基因表达的蛋白活性较高,达2.56×106 U/mL。通过分析不同载体对IFN-α的表达情况,为生产高活性的IFN奠定基础。 相似文献
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旨在构建驯鹿β防御素-1(Reindeerβ-defensin-1,reBD-1)基因的原核表达载体pET-32a(+ )/reBD-1,诱导reBD-1融合蛋白在大肠杆菌中表达,并对其表达产物的生物学活性进行评价.利用RT-PCR技术扩增reBD-1前原肽.从重组克隆载体PMD19T/reBD-1中扩增reBD-1成熟肽编码基因,并克隆入pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21 (DE3)中用IPTG诱导表达reBD-1融合蛋白.表达的融合蛋白扩大培养,进一步纯化后进行体外抑菌试验.结果表明,reBD-1前原肽和成熟肽扩增产物大小分别为215和138 bp,目的基因的序列与驯鹿防御素-1 mRNA序列同源性为100％.前原肽和成熟肽融合蛋白分子量分别为28和24 ku.利用琼脂糖扩散法表明,0.08 mg·mL-1的纯化成熟肽蛋白对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的活性有明显抵抗作用.结果显示,reBD-1前原肽及成熟肽在大肠杆菌中得到了高效表达,其成熟肽对革兰氏阳性菌和阴性菌的活性有抗性. 相似文献
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为利用大肠埃希菌表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白特异性纳米抗体,并对其抗原结合活性进行鉴定,以Cap蛋白特异性纳米抗体基因(vhh cap)序列为模板,利用Primer 5.0软件设计一对通用vhh cap特异性扩增引物,通过PCR方法扩增vhh cap基因片段,经双酶切处理后分别克隆到pCold-SUMO和pET-32a(+)载体上,转化宿主菌E.coli BL21(DE3),使用IPTG进行诱导表达,表达产物通过Ni 2+亲和层析柱进行纯化,经SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定,同时使用ELISA方法对两种载体表达的纳米抗体ELISA效价进行检测和对比分析。SDS-PAGE结果显示pCold-SUMO和pET-32a(+)载体均能实现VHH cap纳米抗体重组蛋白的原核可溶性表达,Western blotting表明纳米抗体重组蛋白可通过6×His-Tag进行检测;ELISA结果显示pCold-SUMO载体表达的纳米抗体重组蛋白效价为1∶500,ELISA效价明显高于pET-32a(+)载体表达产物。PCV2 Cap特异性纳米抗体成功表达为PCV2检测及治疗用新型的抗体开发奠定了基础。 相似文献
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试验以猪塞内卡病毒A(SVA)VP1基因为研究对象,利用基因重组技术构建原核表达载体pET-28a(+)-VP1。重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后经1 mmol/L异丙基茁-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在37益条件下诱导6 h,后经15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳进行检测。结果:SVAVP1基因能在BL21(DE3)中成功表达,融合蛋白相对分子质量约36 kDa;表达的融合蛋白以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,以包涵体为主要存在形式。以上研究结果为后续SVAVP1蛋白的免疫原性的研究及塞内卡病毒病抗体ELISA方法的建立奠定了基础。 相似文献
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鸡生长激素的原核表达、纯化及活性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
鸡生长激素(cGH)是由脑垂体前叶合成并分泌的一种重要的多肽类激素,对于鸡的生长发育具有至关重要的调控作用。为实现cGH的原核表达,将其序列插入原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组表达质粒pET-30a-cGH,并转化大肠杆菌BL21(DE3),挑选阳性菌落液体培养IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测显示,诱导产物在25 ku处含有与预期大小一致的蛋白条带;通过镍柱纯化,得到了较高纯度的cGH重组蛋白;用纯化得到的cGH重组蛋白处理鸡肝癌LMH细胞,检测其IGF-Ⅰ基因mRNA水平上调,证明所得到cGH蛋白具有生物学活性。研究结果为进一步研究cGH的结构、功能和生产应用奠定了基础。 相似文献
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李紫萱 《畜牧兽医科技信息》2023,(2):28-30
为了制备猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）N蛋白,通过PCR扩增获得PEDV的N基因片段与载体pET-32a（+）相连构建原核表达载体pET-32a（+）-PEDV-N。将构建成功的质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG（1 mmol/mL）37℃诱导表达后,采用SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况,对影响重组蛋白表达的诱导时间进行分析。利用Western blot方法分别检测重组蛋白的免疫原性。结果表明：PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测发现条带位置正确,重组质粒pET-32a（+）-PEDV-N测序正确,含有重组质粒pET-32a（+）-PEDV-N的表达菌株BL21（DE3）在诱导表达后,经SDS-PAGE检测证明有重组蛋白表达,利用Western blot结果表明该重组蛋白与PEDV多克隆抗体发生特异性反应,说明成功制备了PEDV-N重组蛋白。 相似文献
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为探究无乳链球菌菌毛岛屿3个亚基AP1、AP2、BP融合蛋白的抗原性,本研究根据该3个亚基基因的主要抗原结构域序列设计并合成引物,通过重叠延伸PCR技术获得上述3个亚基的串联核苷酸片段,并插入pET-30a(+)载体,转化至BL21(DE3)感受态细胞后诱导表达,表达蛋白经亲和层析纯化后进行western blot鉴定和小鼠免疫实验。结果表明,AP1-AP2-BP融合抗原具有良好的反应原性和免疫原性。本研究为进一步研究无乳链球菌基于AP1-BP-AP2融合蛋白的致病机制、检测制剂及亚单位疫苗研制提供了实验依据。 相似文献
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用限制性内切酶SacI和BamHI双酶切克隆有鸡致病性大肠杆菌分离株O1、O2和O78的piliA基因的质粒pTFimO1、pTFimO2和pTFimO78,分别回收从此3质粒上切下的545bp的piliA基因片段,再将载体pET-28a(+)用SacI和BamHI双酶切,最后将pET-28a(+)DNA片段与545bp的piliA DNA片段进行连接,转化至受体菌BL21(DE3)中,经SacI和BamHI酶切反应鉴定重组子,得到了理想重组子质粒pETFimO1、pETFimO2和pETFimO78.重组菌株BL21(DE3) (pETFimO1)、BL21(DE3)(pETFimO2)和BL21(DE3)(pETFimO78)经IPTG诱导后,其表达产物经SDS-PAGE检测,结果表明重组菌株可以良好地表达鸡致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛蛋白. 相似文献
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通过BL21(DE3)原核表达系统制备抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)猪源化单链抗体scFv-Fc。提取抗PEDV杂交瘤细胞2D1的总RNA,通过反转录与SOE-PCR方法获得单链抗体scFv基因,同时提取猪脾脏组织的总RNA,RT-PCR获得猪免疫球蛋白恒定区Fc基因。通过SOE-PCR方法将scFv与Fc连接获得猪源性单链抗体scFv-Fc融合基因,构建重组质粒pET-28a-scFv-Fc,将该重组质粒转入BL21(DE3)原核表达菌进行诱导表达,SDS-PAGE分析及Western blot检测融合蛋白的特异性,再对表达蛋白进行纯化和复性,通过间接ELISA鉴定融合蛋白与PEDV的结合活性。结果显示,插入pET-28a载体的scFv-Fc序列长度1 128bp,抗PEDV猪源化单链抗体的相对分子质量为45 800,重组蛋白具有较高的特异性。本研究成功构建了pET-28a-scFv-Fc原核表达系统,重组蛋白具有较高的免疫反应性,为PEDV重组抗体的研究奠定理论基础。 相似文献