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1.
[目的]为鸡γ-干扰素的进一步研究奠定基础。[方法]根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,设计1对特异性引物。利用RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆鸡γ-干扰素基因,并在IPTG诱导下在大肠杆菌中表达重组菌。[结果]克隆的鸡γ-干扰素基因全长495bp,编码165个氨基酸,与国外克隆的鸡γ-干扰素基因序列的同源性为100%。鸡γ-干扰素蛋白含有12个α螺旋,3个β折叠,7个β转角。它具有强抗原性,而第16～23位氨基酸无抗原性。重组蛋白的分子量约18kD,其经IPTG诱导表达4h后,表达量最高,表达产率高达25%。[结论]鸡γ-干扰素具有一定的抗原性,预示其在免疫反应中起一定作用。 相似文献
2.
构建鸡γ-干扰素基因(lFN-γ)的融合表达质粒,并在原核系统表达。根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,使用prim er5设计一对特异性引物,通过RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆出鸡γ-干扰素基因并对其进行测序。测序结果表明,鸡γ-干扰素基因全长495bp,具有一个完整的开放阅读框,编码164个氨基酸,与国外发表的序列同源性为100%。将序列连接到原核表达载体pET28 a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明鸡γ-干扰素表达蛋白大小为20.8KD,并以包涵体形式表达。为鸡γ-干扰素生物制剂或疫苗佐剂的开发奠定基础。 相似文献
3.
[目的]研究鸡γ-干扰素（ChIFN-γ）的免疫佐剂功能,构建ChIFN-γ与新城疫F蛋白抗原表位（NDV F2-3）的融合基因,并进行原核表达。[方法]以头尾相连的方式构建鸡γ-干扰素基因与NDVF2-3的pET-32a重组质粒,经PCR扩增、双酶切和测序鉴定后,重组子在E.coliBL21细胞进行IPTG诱导融合蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot方法分别检测表达的产物。[结果]获得了726 bpChIFN-γ与NDVF2-3融合基因,经原核表达,融合蛋白分子量约为35 000,能与相应的抗体结合。[结论]ChIFN-γ与NDVF2-3串联基因在原核细胞中能有效表达,且融合蛋白具有一定的免疫活性。 相似文献
4.
猪链球菌2型溶血素融合蛋白的制备及免疫活性测定 总被引：1，自引：1，他引：0
[目的]研究四川资阳脑膜炎病例猪链球菌2型分离株ZYH33溶血素（suliysin,sly）基因的克隆表达及融合蛋白生物活性分析。[方法]从sly中获取第230~593氨基酸残基区域的基因片段,克隆至pMD18-T载体并鉴定,以重组pMD18-T/sly为模板PCR扩增基因片段,与表达载体pQE-30连接,转化至大肠杆菌TG1,重组子经PCR、酶切、测序鉴定。IPTG诱导重组蛋白表达,Western blot法鉴定融合蛋白的抗原性。[结果]基因片段在大肠杆菌中得到了表达,表达的融合蛋白可被猪链球菌2型菌体ZY05719抗血清识别,具有抗原性。[结论]所克隆、表达的溶血素区域可作为猪链球菌的诊断抗原,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
5.
[目的]构建鸡IFN-γ的表达载体。[方法]采用PCR方法从pcDNA-ChIFN-γ重组质粒中扩增得到鸡IFN-γ基因,将目的基因定向克隆至能够在大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达的pQE trisystem载体内,转化大肠杆菌M15菌株,以IPTG诱导表达8×H is-tag标签蛋白并对其进行纯化。[结果]通过SDS-PAGE检测方法表明,ChIFN-γ基因片段成功表达。[结论]鸡IFN-γ的表达载体成功构建。 相似文献
6.
用PCR技术从含鸡IL-18全长基因质粒扩增出编码鸡IL-18成熟蛋白基因，亚克隆于pPROEX^TM HTa原核表达载体上，重组质粒转化大肠杆菌感受态DH5a中，随机筛选到阳性重组质粒，经酶切和测序证实目的基因止确克隆于表达载体。IPTG诱导，重组蛋白以包涵体形式表达。薄层扫描结果表明表达产物约占菌体总蛋白的21．95％，用Ni-NTA树脂纯化重组蛋白，免疫SPF鸡制备抗血清。Western blot结果显示鸡抗血清可以很好地和所表达的蛋白带特异结合。ELISA可以检测到较高的多克隆抗体效价，表明此蛋白具有良好的抗原性。 相似文献
7.
依据鸡γ-干扰素基因(ChIFN-γ)的氨基酸序列,采用油菜偏嗜性的密码子,人工合成ChIFN-γ,构建原核表达载体pET32a-ChIFN-γ,并转化到E. coli BL21中.1 mmol·L-1 IPTG 37℃诱导表达12h ChIFN-γ表达量达到菌体总蛋白的37%.SDS-PAGE电泳检测表明,ChIFN-γ重组蛋白分子量约为33kDa.研究为下一步制备ChIFN-γ抗体进行真核表达研究奠定了基础. 相似文献
8.
[目的]利用大肠杆菌可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白。[方法]根据IBDV vp2全长序列(Gen Bank登入号AY704912),设计一对缺失VP2蛋白N-端80个氨基酸残基的特异性引物,克隆IBDV HQ株的vp2基因,插入质粒p ET-22b中构建大肠杆菌周质表达质粒p ET-22b-vp2,经IPTG诱导后表达重组蛋白。[结果]在SDS-PAGE中可见大小约为39 k Da重组蛋白。重组蛋白纯化后,Western Blot检测表明其具有良好的反应原性。[结论]在大肠杆菌细胞周质中可以高效地可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒IBDV VP2蛋白,并且该重组蛋白有较好的免疫原性,可以为后续亚单位疫苗及检测试剂盒开发提供所需的蛋白。 相似文献
9.
[目的]克隆鸡干扰素基因刺激蛋白(STING)胞外区基因并进行原核表达,为了解STING蛋白的生物学功能及探讨禽类的固有免疫机制打下基础.[方法]采用RT-PCR扩增鸡STING胞外区基因,与原核表达载体pGEX-4T-1连接构建重组表达质粒,再转化BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行12% SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析.[结果]三黄鸡STING胞外区基因全长951 bp,与原核表达载体pGEX-4T-1可成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-STING,转化BL21 (DE3)感受态细胞后经1.0 mmol/L IPTG诱导表达4h,12% SDS-PAGE电泳检测得到一个带GST标签约62 ku的融合蛋白,采用抗GST多克隆抗体进行Western blotting鉴定,约在62 ku处可见一条明显的蛋白印迹条带,表明目的蛋白原核表达正确,且特异性较高.[结论]从三黄鸡外周血淋巴细胞中克隆获得的STING胞外区基因片段可在原核细胞中高效表达,且纯化后的融合蛋白可用于制备鸡STING多克隆抗体. 相似文献
10.
通过SOE-PCR技术获得PstS基因全长并克隆到pColdⅠ,将重组表达载体pCold-PstS转化进BL21(DE3)后经IPTG诱导表达融合蛋白PstS,将其纯化后免疫新西兰兔制备多克隆兔抗血清,提取鸡毒支原体总蛋白、膜蛋白和胞浆蛋白,通过Western blot分析PstS蛋白的亚细胞定位.结果表明,PstS基因长度为1 065 bp,其蛋白在氨基酸9～31之间存在跨膜区,pCold-PstS经诱导表达获得融合蛋白PstS(存在于细胞膜和胞浆中),其约43 ku并具有较好的抗原性. PstS蛋白是鸡毒支原体膜表面的免疫原性蛋白,可为进一步研究其生物学功能和基因工程疫苗提供依据. 相似文献
11.
[目的]对小鼠Klf4基因重组蛋白进行原核表达分析。[方法]利用双酶切从重组质粒p MXs-Klf4上回收小鼠Klf4基因片段,克隆入p ET-41a(+)载体后转化BL21大肠杆菌,用IPTG诱导表达,探讨诱导表达最佳浓度和时间,最后采用SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定及分析。[结果]重组质粒Klf4-p ET-41a(+)在IPTG诱导下可表达与预期相符的约为51 ku的KLF4蛋白;经IPTG刺激后重组蛋白表达增多,以0.8 mmol/L IPTG诱导6 h为佳;重组蛋白以包涵体形式存在于大肠杆菌BL21中。[结论]小鼠Klf4基因可在原核细胞中表达。 相似文献
12.
根据GenBank已发表的鸡γ干扰素（ChIFN-γ）eDNA基因序列设计一对引物,以ConA刺激8h后的鸡全血淋巴细胞提取的总RNA为模板．通过RT—PCR方法克隆出ChIFN-γ基因,将其连接到pMD18-T载体上获得阳性重组质粒。测序结果表明,该ChIFN-γ与GenBank上发表的ChIFN-γ序列的同源性可达99．6％,其含有1个495bp的开放性阅读框架,编码164个氨基酸。通过KpnⅠ和NotⅠ两个酶切位点将该基因插入酵母表达载体（pPICZa—A）,并将该重组酵母ChIFN-γ载体线性化,通过电转化使ChIFN-γ基因整合到酵母（X-33）基因组上,经甲醇诱导后,成功表达出ChIFN-γ。利用Western—blotting分析测定表达的ChIFN-γ蛋白的活性。结果表明,本试验得到的重组酵母ChIFN-γ是具有反应原性的蛋白。 相似文献
13.
【目的】开展青鱼γ-干扰素(IFN-γ)基因的克隆、结构特征与表达谱分析研究。【方法】采用cDNA末端快速扩增技术获得了青鱼(Mylopharyngodon piceus)IFN-γ基因cDNA的5′和3′末端序列,然后根据其末端序列设计特异性引物,扩增得到青鱼IFN-γ基因cDNA全长序列,对其序列和编码氨基酸序列进行生物信息学、同源性比较及系统进化树分析,同时对其在青鱼各组织中的表达进行分析。通过构建真核表达载体,将其转染青鱼鳍条组织细胞进行表达分析。【结果】青鱼IFN-γcDNA全长为895bp,其开放阅读框大小为549bp,编码182个氨基酸。氨基酸序列比对分析结果显示,青鱼IFN-γ与人、鸡、鼠IFN-γ的序列相似性仅为1.5%~7.7%,与其他鱼类IFN-γ序列相似性较高,为16.3%~92.9%。青鱼IFN-γ分子N末端包含1个信号肽序列、C末端有IFN-γ特征序列([I/V]-QX-[K/Q]-A-X2-E-[L/F]-X2-[I/V])以及核定位基序(RRRR)。青鱼IFN-γ蛋白二级结构与高等脊椎动物IFN-γ类似,包含7个α螺旋结构。经Poly I:C诱导后发现,IFN-γ在青鱼头肾、肾、脾、皮肤和鳃组织中表达显著上调,最高的为头肾,其次为脾、皮肤、鳃和肾,而在心脏和脑组织中无显著变化。青鱼γ-干扰素真核表达质粒在青鱼鳍条组织细胞中成功表达IFN-γ。【结论】成功克隆了青鱼IFN-γ基因cDNA,经Poly I:C诱导后,该基因在头肾中上调倍数最为显著,青鱼γ-干扰素在体外获得表达。 相似文献
14.
AA肉鸡IFN-γ的表达及蛋白结构的初步预测 总被引：1，自引：1，他引：0
为了进一步研究肉鸡Ⅱ型干扰素(ChIFN-γ)蛋白的结构与功能,将新城疫Ⅳ系苗接种于9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔中,诱生ChIFN-γ,提取脾脏总RNA,经过RT-PCR扩增出ChIFN-γ基因cDNA,测序后亚克隆至原核表达载体pProEXTMHTb中,转化大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE及Westen Blot检测,利用DNAStar软件包中的Editseq将ChIFN-γ核苷酸序列翻译成氨基酸序列,然后利用Protean软件进行氨基酸序列分析,对蛋白的二级结构进行初步预测,利用自动比较蛋白同源建模的服务器Swiss-Model对ChIFN-γ的氨基酸序列进行三级结构预测。结果显示,所克隆的ChIFN-γ序列大小为495bp,与Digby和Lowenthal首次克隆的鸡Ⅱ型干扰素的同源性为99.8%。表达出预期大小(18ku左右)的融合蛋白,可以与His单克隆抗体发生特异性反应,蛋白质结构预测表明,ChIFN-γ蛋白具有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区段,其解螺旋最低能量值为-4245.698kJ·mol-1,有6个α螺旋结构。 相似文献
15.
根据现有鸡γ－干扰素基因序列设计引物，应用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）技术，从Con A诱导培养的鸡脾淋巴细胞中扩增得到石岐杂鸡γ－干扰素（spzChIFN-γ)基因，将克隆到pGEM-T载体中，进行序列测定，结果表明，克隆得到的ChIFN-γ基因的开放阅读框架由492个核苷酸组成，和其他ChIFN-γ基因的同源性达99％，与火鸡γ－干扰素基因的同源性性为96％，与鸭γ－干扰素基因的同源性为81％，推导的石岐杂鸡IFN-γ氨基酸序列与其他已发表的ChIFN-γ氨基酸序列完全一致，与火鸡和鸭IFN－γ氨基酸同源性分别为97％和67％。 相似文献
16.
[目的]克隆、表达牦牛源多杀性巴氏杆菌(Pm)外膜蛋白基因H(ompH)并鉴定其抗原性.[方法]扩增牦牛源多杀性巴氏杆菌去信号肽的ompH基因,构建原核表达载体pET28a - ompH,转化大肠杆菌BL21( DE3)并诱导表达,通过SDS-PAGE鉴定表达目的蛋白,利用Western blot检测该蛋白的抗原性.[结果]成功克隆、构建了牦牛源多杀性巴氏杆菌去信号肽的pET28a - ompH原核表达载体.诱导表达蛋白约38 kDa,Western blot检测重组蛋白具有良好的抗原性.[结论]ompH基因的成功表达为重组OmpH蛋白的血清学检测方法的建立、多克隆抗体的制备及疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
17.
[目的]旨在克隆绵羊激活素受体 IIB （ActRIIB）基因,并构建原核表达载体进行体外表达,为进一步验证功能奠定基础。[方法]以绵羊肝脏组织为材料,以提取总 RNA反转录得到的 cDNA为模板,利用同源序列克隆技术,对绵羊 ActRIIB基因的 cDNA全长进行克隆,并对其进行生物信息学分析。再根据克隆序列设计引物,将其与原核表达载体 pET41a连接,构建重组表达质粒 pET41a-ActRIIB,经IPTG诱导后进行表达鉴定。[结果]扩增获得绵羊ActRIIB基因cDNA全长1564 bp（ Genbank登陆号为：JX422071.1）,最大开放阅读框为1539 bp,共编码512个氨基酸;其氨基酸序列与牛的同源性最高（99.6%）,ActRIIB的 C末端区域高度同源且属于 TGFβ家族。原核诱导表达获得符合预期大小（约92 kD）并带有组氨酸标签序列的 ActRIIB重组蛋白。[结论]绵羊 ActRIIB基因的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。 相似文献
18.
《（《农业科学与技术》）编辑部》2014,(10)
[目的]旨在克隆绵羊激活素受体IIB(ActRIIB)基因,并构建原核表达载体进行体外表达,为进一步验证功能奠定基础。[方法]以绵羊肝脏组织为材料,以提取总RNA反转录得到的cDNA为模板,利用同源序列克隆技术,对绵羊ActRIIB基因的cDNA全长进行克隆,并对其进行生物信息学分析。再根据克隆序列设计引物,将其与原核表达载体pET41a连接,构建重组表达质粒pET41a-ActRIIB,经IPTG诱导后进行表达鉴定。[结果]扩增获得绵羊ActRIIB基因cDNA全长1 564 bp(Genbank登陆号为:JX422071.1),最大开放阅读框为1 539 bp,共编码512个氨基酸;其氨基酸序列与牛的同源性最高(99.6%),ActRIIB的C末端区域高度同源且属于TGFβ家族。原核诱导表达获得符合预期大小(约92 kD)并带有组氨酸标签序列的ActRIIB重组蛋白。[结论]绵羊ActRIIB基因的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。 相似文献
19.
[目的]研究牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因的克隆及原核表达。[方法]采用PCR方法扩增牛瑟氏泰勒虫中国延边株P23基因片段,将扩增产物克隆入pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-P23,经PCR、双酶切鉴定后测序;将目的基因片段亚克隆入表达载体pGEX-4T-1构建重组表达质粒pGEX-4T-P23,转化宿主菌BL21获得重组菌。通过对诱导条件的优化,根据SDS-PAGE确定表达蛋白的最佳表达条件;Western-blotting检测表达蛋白的反应原性。[结果]所克隆的牛瑟氏泰勒虫P23基因片段长507 bp,与牛瑟氏泰勒虫日本株P23基因的核苷酸同源性达99.4%,表达的融合蛋白大小约为46 ku;诱导时机以接种培养后2 h为最佳,诱导时间以6 h为最佳,诱导温度以34℃为最佳,0.008-1.000 mmol/L的IPTG对表达量的影响不大。Western blotting检测表明该蛋白具有较好的抗原性。[结论]为牛瑟氏泰勒虫病的免疫学诊断和预防等研究奠定了基础。 相似文献
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【目的】克隆鸡白痢沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因并进行原核表达,分析重组蛋白invA的抗原性,为沙门氏菌快速诊断试纸条和新型表位疫苗的研发提供理论依据。【方法】以鸡白痢沙门氏菌野毒株为供试菌,克隆其invA基因,对invA基因编码的蛋白进行生物信息学分析。将invA基因克隆到pET-30a原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a-invA,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析,检测其目的蛋白的表达情况和免疫反应特性。【结果】成功获得了1 143bp的完整的invA基因,编码381个氨基酸。生物信息学分析结果表明,invA基因编码的蛋白有17个抗原决定簇,其跨膜区域明显,92-105位氨基酸为low complexity典型结构域。构建获得了原核重组表达质粒pET-30a-invA,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了约51ku的invA融合蛋白;Western-blot检测结果显示,该融合蛋白具有良好的免疫反应性。【结论】成功克隆出了1 143bp大小invA基因,明确了其编码蛋白的生物信息,其诱导表达后获得免疫反应性良好的重组蛋白。 相似文献