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表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
【目的】以伪狂犬病病毒为载体，构建表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组病毒，并研究其生物学特性。【方法】将猪2型圆环病毒ORF2基因插入到伪狂犬病病毒gG缺失通用转移载体中，构建猪2型圆环病毒-伪狂犬病病毒重组中间转移质粒，然后将该质粒与伪狂犬病病毒TK-/gG-/LacZ+基因组共转染IBRS-2细胞，待发生细胞病变后收集病毒液进行重组病毒的筛选及生物学特性测定。【结果】利用检测PCV2 ORF2基因和LacZ基因的PCR方法筛选到重组病毒TK-/gG-/ORF2+，同时用Southern blotting证实外源基因PCV2 ORF2已成功插入到TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组中。间接免疫荧光试验（IFA）和Western blotting结果显示重组病毒中PCV2 ORF2基因获得了成功表达。对重组病毒的生物学特性研究表明，重组病毒与其亲本株在不同细胞上的增殖滴度相当，且重组病毒对小鼠无致病性，免疫小鼠后可诱导机体产生抗ORF2蛋白的特异性抗体。【结论】重组伪狂犬病毒构建成功，且表达的ORF2蛋白具有免疫原性。 相似文献
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《北京农学院学报》2020,(3)
【目的】建立针对猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的一种双重PCR检测方法。【方法】先优化猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的单独PCR检测方法条件,在此基础上优化这2种猪圆环病毒的双重PCR检测方法条件,之后进行其特异性与灵敏度的检测,并进行初步临床应用检测。【结果】建立的猪圆环病毒2型与猪圆环病毒3型双重PCR检测方法对猪圆环病毒1型、猪细小病毒、伪狂犬病病毒等当前常见猪源DNA病毒的检测结果都是阴性,检测猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的灵敏度分别是610、800 copies/μL。该方法对120份仔猪样品的检测结果显示,猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的检出率分别为56.7%和38.3%,虽然稍低于各自单独PCR检出率;但并没有显著差异(P0.05),且与单独PCR检测方法的符合率都达到95%以上。【结论】建立了一种特异性强、敏感性高的猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双重PCR检测方法,为区分猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型提供了一种快速检测方法。 相似文献
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【目的】为研制针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的疫苗提供候选毒株。【方法】构建针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的gE/gI缺失重组转移质粒pMD-LA-RA及携带EGFP标记基因的重组转移质粒pMD-LA-EGFP-RA,将pMDLA-EGFP-RA与伪狂犬病病毒流行毒株PRV AH进行同源重组,利用EGFP为筛选标记,获得携带EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–/EGFP~+,以此毒株与pMD-LA-RA进行第2次同源重组,筛选去除EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–,并通过生长曲线、易感细胞连续传代和动物免疫评价其增殖能力、遗传稳定性及免疫原性。【结果】通过2次同源重组,结合荧光观察、空斑纯化和PCR检测,成功获得了PRV AH gE~–/gI~–,经PCR鉴定、荧光观察及测序鉴定,证实该毒株g E和g I基因被成功缺失,且不携带EGFP标记基因。生物学特性研究结果表明,该毒株增殖能力与亲本毒株相当,遗传稳定性及免疫原性良好。【结论】采用同源重组技术成功构建了免疫原性良好的猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI基因缺失突变株,为研制针对流行毒株的基因缺失疫苗奠定了一定的基础。 相似文献
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为调查黑龙江省某规模化猪场猪伪狂犬病野毒感染与疫苗免疫情况,运用酶联免疫吸附试验(ELISA)对今年4月份和7月份随机采集于该场的395份血清样本进行猪伪狂犬病病毒gE和gB抗体检测.结果表明:该规模化猪场两次猪伪狂犬病病毒gE抗体检测阳性率均为0,说明猪场现阶段不存在猪伪狂犬病野毒感染;两次检测基础猪群伪狂犬病病毒g... 相似文献
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《西南农业学报》2019,(11)
【目的】建立猪捷申病毒(PTV)反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的检测方法,并应用于广西猪群PTV感染诊断。【方法】通过对GenBank中登录的PTV不同血清型基因序列,在5’端保守区设计一对特异性引物,经退火温度摸索及特异性和敏感性试验,建立PTV的RT-PCR检测方法,并对广西部分猪场腹泻病例进行猪捷申病的感染诊断。【结果】所建立的方法能特异性地扩增PTV,不能扩增猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒、猪C群轮状病毒、猪丁型冠状病毒。建立的方法具有较高的敏感性,可检测低至1.16 pg/μl的质粒模板及12.15 pg/μl的核酸模板。应用建立的RT-PCR方法对2018年3月-2019年4月从广西部分猪场采集的235份病猪腹泻粪便进行PTV临床检测,PTV阳性为24份,阳性率为10.21%。【结论】建立的PTV RT-PCR方法简单特异、灵敏度高,可适用于实验室PTV检测诊断。广西部分受检猪场已存在PTV感染,应予以警惕,加强监测与防控。 相似文献
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【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。 相似文献
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【目的】实现快速、准确地对猪脑心肌炎进行临床诊断和病原学检测。【方法】根据GenBank中已发表的猪脑心肌炎病毒（EMCV）3D基因序列设计合成1对特异性引物,优化反应条件,建立了EMCV一步法RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。【结果】一步法RT-PCR可以从EMCVB JC3株中扩增出与试验设计相符的286bp特异性片段,而对猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、BHK-21正常细胞的扩增结果均为阴性;对EMCVBJC3株细胞毒的敏感度达到2TCID50;对10份EMCVB JC3株细胞毒进行重复性检测,结果均一致;对207份临床疑似发病猪的病料进行检测,其阳性检出率为9.18%。【结论】所建立的EMCV一步法RT-PCR检测方法具有特异、灵敏、高效、快速等特点,可用于EMCV的临床检测及流行病学调查。 相似文献
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【目的】实现快速、准确地对猪脑心肌炎进行临床诊断和病原学检测。【方法】根据GenBank中已发表的猪脑心肌炎病毒（EMCV） 3D基因序列设计合成1对特异性引物,优化反应条件,建立了EMCV一步法RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。【结果】一步法RT-PCR可以从EMCV BJC3株中扩增出与试验设计相符的286 bp特异性片段,而对猪口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、BHK-21正常细胞的扩增结果均为阴性;对EMCV BJC3株细胞毒的敏感度达到2 TCID50;对10份EMCV BJC3株细胞毒进行重复性检测,结果均一致;对207份临床疑似发病猪的病料进行检测,其阳性检出率为9.18%。【结论】所建立的EMCV一步法RT-PCR检测方法具有特异、灵敏、高效、快速等特点,可用于EMCV的临床检测及流行病学调查。 相似文献
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【目的】研究兰州百合及有斑百合的染色体核型。【方法】利用染色体常规压片的方法,对兰州百合和有斑百合的染色体数目及核型进行了研究和分析。【结果】兰州百合的核型公式为2n=2x=24=2m+2sm+6st+14t,相对长度为6.35%～12.07%,核型不对称系数为83.25%,染色体相对差异较大。有斑百合的核型公式为2n=2x=24=4m+12st+8t,相对长度为6.11%～12.90%,核型不对称系数为80.11%。【结论】兰州百合的核型类型属于3A型,有斑百合的核型类型为3B型,以有斑百合核型的进化较高,可见不同居群的百合间核型存在差异。 相似文献
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为明确加州新小绥螨Neoseiulus californicus(McGregor)对截形叶螨Tetranychus truncate(Ehara)的捕食潜力,采用捕食者功能反应方程及参数研究加州新小绥螨对截形叶螨各螨态捕食作用。结果表明,加州新小绥螨对雌成螨、若螨、卵的选择性捕食系数分别为0.365、1.276和1.390。在不同温度条件下,加州新小绥螨对截形叶螨的功能反应均属于HollingⅡ型;对猎物卵和幼若螨的控制能力最强。在试验温度范围内,加州新小绥螨的捕食能力随温度升高呈先增后减趋势,28℃时最强,对截形叶螨雌成螨、若螨和卵的攻击系数(a)最大,分别为0.639、0.730和0.842;处理时间最短,分别为0.126、0.075和0.039d;最大日捕食量分别为7.943头、13.405头和25.575粒。加州新小绥螨的捕食作用存在较强的种内干扰反应,随着捕食者密度的增大,平均捕食量逐渐减少,捕食作用率也相应降低,捕食作用率与其自身密度的关系为E=0.423P-0.747。 相似文献
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旨在建立一种可以应用于临床样本同时检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌感染的多重PCR方法。根据NCBI上已收录的沙门菌hut基因、多杀性巴氏杆菌 kmt1基因和大肠埃希菌23SrRNA基因的全基因序列,设计并合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能够同时检测3种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法可以从沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌以及3种细菌的混合物中扩增出3条大小分别为286 bp、457 bp和652 bp的特异性条带,其他对照组检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的最低检出量分别为1.77×10 、1.99×10 、2.01×10 CFU/mL;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中检测出3种病原菌。可见：所建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的混合感染。 相似文献
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【目的】对美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia进行分子生物学鉴定,确定该蓟马体内Wolbachia的进化位置,为进一步探讨Wolbachia对其生殖作用的调控机制提供理论依据。【方法】以wsp基因为目的基因,对美洲棘蓟马体内的共生菌Wolbachia进行特异性扩增和测序,使用Clustal X 1.83软件对所得DNA序列进行比对;在MEGA 4.0软件中采用邻接法对Wolbachia的系统发育关系进行分析。【结果】利用wsp基因的特异性引物从美洲棘蓟马体内扩增出了632 bp的Wolbachia的wsp基因片段(GenBank登录号为JN315668),580 bp的Wolbachia A群的wsp基因片段和405 bp的Mel亚群的wsp基因片段。系统发育分析结果表明,美洲棘蓟马体内的Wolbachia与黑腹果蝇亲缘关系较近。【结论】美洲棘蓟马体内感染的Wolbachia属于A群Mel亚群。 相似文献
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通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少. 相似文献
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【目的】在昆虫草地贪夜蛾细胞(Sf9)中表达一种能专一阻断昆虫钠、钾离子通道的神经毒素基因RjAa17f。【方法】运用杆状病毒真核表达系统表达RjAa17f毒蛋白,并用蛋白质印迹对其进行检测;测定RjAa17f毒蛋白引起健康棉铃虫中肠膜电位的变化,并对其毒力进行测定。【结果】通过重组杆状病毒质粒的转染和Western blot检测验证,神经毒素基因RjAa17f的重组Bacmid已经成功转染到Sf9细胞中,且在Sf9中表达出与预测大小一致的RjAa17f目的蛋白;此毒蛋白作用于棉铃虫中肠3~12h后,中肠膜电位与CK相比差异显著,且随着作用时间的延长,棉铃虫中肠膜电位呈逐步升高的趋势,作用9h以后,升高的幅度逐渐降低,趋于平缓。RjAa17f毒蛋白对棉铃虫的LD50为108.12μg/g。【结论】在Sf9细胞内表达出了有活性的RjAa17f毒蛋白,且该毒蛋白对棉铃虫中肠膜电位有显著改变。 相似文献
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【目的】探明植物杂种后代减数分裂异常与花粉败育之间的关系。【方法】通过甘蓝型油菜与黑芥种间杂交和基因组加倍,获得芸薹属三基因组双倍体,采用基因组原位杂交方法,观察三基因组双倍体花粉母细胞的减数分裂规律。【结果】与单倍体相比,双倍体花粉育性得到一定恢复,但可育花粉的比例较低,只有10%~20%。基因组原位杂交结果显示,双倍体花粉母细胞减数分裂终变期染色体以形成同源二价体为主,但也有部分染色体形成四价体或六价体。四价体有3种形式:B基因组染色体形成的四价体、AC基因组染色体形成的四价体及B与AC基因组之间形成的异配四价体。减数分裂后期Ⅰ染色体均等分离的细胞占总数的70%左右,在第2次减数分裂期也观察到非正常分裂如非四分孢子、微核等现象。【结论】减数分裂过程中的染色体异常行为可能是导致花粉育性不高的重要原因;虽然不正常的减数分裂导致花粉育性下降,但双亲染色体的异源联会可为双亲遗传物质的交换提供条件。 相似文献
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为探明长枝木霉T6菌株对美洲南瓜枯萎病菌的作用机理，采用对峙培养、显微观察、孢子萌发、室内防效测定等方法研究其抑制能力和防治效果。结果表明：长枝木霉T6菌株对美洲南瓜枯萎病菌具有较强的抑制作用，对峙培养7 d时，长枝木霉T6菌株对该病菌的抑制率为60.09%；显微形态观察表明：长枝木霉T6菌株菌丝与美洲南瓜枯萎病菌菌丝发生缠绕；长枝木霉T6菌株发酵液对美洲南瓜枯萎病菌分生孢子萌发具有明显的抑制作用，抑制率为31.00%；长枝木霉T6菌株对美洲南瓜枯萎病具有较好的防治效果，室内盆栽防效为69.06%。 相似文献
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构建表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的重组口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株并评价其生物学特性。将细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合基因插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,将重组质粒分别电转入减毒鼠伤寒沙门菌X3770和X4550,获得重组疫苗菌株St-Eg95-Eg.ferritin,对重组菌的稳定性、生长状态及安全性进行分析。结果表明,经PCR和酶切鉴定成功构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,Western blot检测Eg95-Eg.ferritin蛋白在重组菌中获得表达;生物学特性研究结果表明,重组质粒可稳定存在,且不影响重组菌的生长状态,小鼠口服试验证实,重组菌安全无毒性。成功构建能稳定表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株,将为研究包虫病口服基因工程疫苗奠定基础。 相似文献