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1.
大肠杆菌多药耐药基因AcrA的克隆及其原核表达 总被引：1，自引：1，他引：0
从大肠杆菌AcrA的编码序列中设计引物,以大肠杆菌基因组为模板,扩增出AcrA基因中约691 bp的cDNA片段,将所得片段与pMD-18T载体连接,转化到DH5a大肠杆菌中,成功地筛选到阳性克隆,其质粒测序结果与文献报道一致.从阳性克隆中提取质粒,经HindⅢ和BamH I酶解,回收691 bp的目的片段,定向克隆到pET-28a表达载体中,提取质粒,再次转化到BL21(DE3)中,成功地筛选出阳性克隆.经IPTG诱导阳性菌,通过SDS-PAGE检测出AcrA部分基因的表达. 相似文献
2.
根据GenBank中大肠杆菌的soxS基因序列设计引物,以大肠杆菌ATCC25922的基因组为模板,PCR扩增出约324 bp的soxS基因片段,将所得片段与pMD18-Tsi mple vector连接,转化至J M109大肠杆菌中,成功地筛选到阳性克隆,其质粒序列测序结果与GenBank中报道一致。从阳性克隆中提取质粒,经BamHⅠ和XhoⅠ酶解,回收324 bp的目的片段,定向克隆到pET-28a表达载体中,提取质粒,再次转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,获得表达产物,通过SDS-PAGE检测出soxS基因的表达。 相似文献
3.
枯草杆菌多重耐药基因bmr的克隆及原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
根据BenBank上已公布的多重耐药基因bmr的编码序列设计1对引物．以枯草杆菌基因组为模板，扩增出1170bp的DNA片段，将所得片段与pMD18T载体连接，转化到DH5α大肠杆菌中，成功地筛选到阳性克隆，其扩增片段测序结果与文献报道序列同源性达98．81％。将该片段定向克隆到pET-28a（＋）表达质粒中。提取质粒转化到BL21（DE3）中，经1mmol／l。IPTG诱导阳性菌．通过SDS-PAGE检测出bmr基因的表达产物。 相似文献
4.
大肠杆菌多重耐药调控基因evgS的克隆及其原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
以大肠杆菌ATCC25922的基因组为模板,根据GenBank中大肠杆菌的evgS基因序列设计引物,PCR扩增出约894 bp的基因片段,将所得片段与pMD18-T simple vector连接,转化至大肠杆菌JM109中,筛选阳性克隆,其质粒中插入序列测序结果与GenBank中报道一致.提取阳性克隆质粒,经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,回收目的片段,定向克隆到pET-28a原核表达载体中,提取阳性质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,获得阳性克隆.经IPTG诱导阳性菌,收集表达产物,通过SDS-PAGE分析证实,pET-28a-evgS可成功地在大肠杆菌中表达EvgS蛋白.Western-blot检测证明,表达产物具有良好的反应原性. 相似文献
5.
《黑龙江畜牧兽医》2010,(13)
为获得MarR多克隆抗体,试验以大肠杆菌ATCC25922基因组为模板,根据GenBank中大肠杆菌的marR基因序列设计引物,PCR扩增出长约435bp的marR基因片段,将所得片段与pMD18-T载体连接,转化至JM109大肠杆菌中,筛选阳性克隆,其质粒中插入序列的测序结果与GenBank中报道一致,从阳性克隆中提取质粒,经BamHⅠ和XhoⅠ酶切回收435bp的目的片段,定向克隆到pET-28a(+)表达载体中,提取阳性质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中获得阳性克隆。结果表明:经IPTG诱导阳性菌收集表达产物,通过SDS-PAGE分析证实marR基因得到表达;经Western-blot检测该蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
6.
猪肌生成抑制素C末端80氨基酸编码基因的合成及其原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
将猪肌生成抑制素编码序列下游883-l126bp按大肠杆菌嗜好密码子进行优化，将优化后序列双链分成l2个单链片段(F1、F2、F3、R6、R5、R4、F4、F5、F7、R3、R2、R1)，采用化学合成方法合成，每对相邻互补片段之间有20bp序列交叉重叠。F1长38bp，Rl长36bp，其他片段均40bp长，Fl和R1片段两端分别加上限制性内切酶NcoI和XhoI的识别位点序列。经PCR扩增出254bp片段，该片段与pMDl8—T载体连接，转化JMl09感受态细胞，所得阳性克隆进行测序分析，得到的克隆序列与设计的序列完全一致，表明成功地获得了猪肌生成抑制素下游编码序列克隆载体。从阳性细菌中提取质粒，经NcoI和XhoI酶切，回收254bp目的片段，定向克隆到pET28a中，转化DH5α受体菌，提取质粒，再转化到BL2l(DE3)中，成功筛选出阳性克隆。阳性菌经IPTG诱导，通过SDS—PAGE，检测出猪肌生成抑制素的表达。 相似文献
7.
猪Ghrelin基因的克隆及原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
从猪下丘脑、胃等组织中提取总RNA，根据已发表的猪的Ghrelin mRNA序列设计合成引物，通过RT-PCR进行cDNA扩增，获得了282bp的片段。将该片段克隆于pMD-18T载体后进行序列分析，确认PCR产物为Ghrelin cDNA。从阳性克隆中提取质粒，经NheⅠ和XhoⅠ双酶切，回收282bp的目的片段，定向克隆到pET-28a表达载体中，提取质粒并再次转化到BL21（DE3）中，成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS-PAGE检测出猪Ghrelin基因的表达． 相似文献
8.
从猪肌生成抑制素(MSTN)cDNA序列中设计引物。以pMD18-T-MSTN质粒为模板，PCR扩增猪MSTN成熟蛋白编码序列，该片段全长1095bp。将所得片段与pMD18-T载体连接，构建重组质粒pMT—mpMSTN，将其转化到大肠杆菌DH5a中，成功地筛选到阳性克隆。双酶切重组质粒pMT—mpMSTN和真核表达载体pcDNA3．1，连接目的片段与载体pcDNA3．1，转化大肠杆菌DH5a，经酶切、PCR及测序分析，表明成功地构建了真核表达质粒pcDNA3．1-mpMSTN。 相似文献
9.
从健康新生牛大网膜脂肪组织中提取总RNA,根据已发表的牛Resistin mRNA序列设计、合成引物,通过RT-PCR进行cDNA扩增,获得了343 bp的片段。将该片段克隆于pMD18-T载体后进行序列分析,确认PCR产物为牛Resistin cDNA。从阳性克隆中提取质粒,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,回收343 bp的目的片段,定向克隆到pGEX-6P-1表达载体中,提取质粒并再次转化到BL21(DE3)中,成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,通过SDS-PAGE检测出牛的Resistin基因的表达。 相似文献
10.
溆浦鹅卵泡抑制素α亚基编码区cDNA克隆及其原核表达 总被引：2，自引：0，他引：2
根据GenBank中鸡卵泡抑制素α亚基序列设计引物，对该序列按大肠杆菌嗜好密码子进行优化，在设计的引物两端分别加上限制性内切酶SacⅠ和XhoⅡ的识别位点序列。利用RT-PCR技术从溆浦鹅卵泡的颗粒细胞总RNA中扩增出抑制素α亚基成熟区序列，经PCR扩增出354bp片段，该片段与pMD18-T载体连接，转化JM109感受态细胞，所得阳性克隆进行双酶切鉴定和PCR鉴定，并进行了测序分析，得到的克隆序列与设计的序列基本一致。表明成功地获得了抑制素α亚基编码序列的克隆载体。从阳性细菌中提取质粒，经SacⅠ和XhoⅠ酶切，回收354bp目的片段，定向克隆到pET28a中，转化DH5α受体菌，提取质粒，再转化到BL21(DE3)中，成功筛选出阳性克隆。阳性菌经IPTG诱导，通过SDS-PAGE，检测出溆浦鹅卵泡抑制素α亚基编码区的表达。 相似文献
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猪肌生成抑制素C末端80氨基酸编码基因的合成及其原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
将猪肌生成抑制素编码序列下游883～1 126 bp按大肠杆菌嗜好密码子进行优化,将优化后序列双链分成12个单链片段(F1、F2、F3、R6、R5、R4、F4、F5、F6、R3、R2、R1),采用化学合成方法合成,每对相邻互补片段之间有20 bp序列交叉重叠.F1长38 bp,R1长36 bp,其他片段均40bp长,F1和R1片段两端分别加上限制性内切酶Nco I和Xho I的识别位点序列.经PCR扩增出254 bp片段,该片段与pMD18-T载体连接,转化JM109感受态细胞,所得阳性克隆进行测序分析,得到的克隆序列与设计的序列完全一致,表明成功地获得了猪肌生成抑制素下游编码序列克隆载体.从阳性细菌中提取质粒,经Nc0 I和Xho I酶切,回收254 bp目的片段,定向克隆到pET28a中,转化DH5.受体菌,提取质粒,再转化到BL21(DE3)中,成功筛选出阳性克隆.阳性菌经IPTG诱导,通过SDS PAGE,检测出猪肌生成抑制素的表达. 相似文献
13.
通过电子克隆手段,克隆到大小为959bp的cDNA序列。然后从鸡的脾脏提取RNA,用RT-PCR方法扩增出目的片段。将该片段连接到原核表达载体pET-32a和真核表达载体pEGFP-C1中,采用SDS-PAGE检测原核表达载体pET-BCL10在大肠杆菌中的表达,脂质体转染法将真核表达载体pEGFP-BCL10转入vero细胞,Western blotting检测其在细胞中的表达。结果显示,PCR扩增到735bp的DNA片段,原核表达载体和真核表达载体经双酶切和核酸测序表明载体构建成功。SDS-PAGE电泳检测到pET-BCL10重组质粒在大肠杆菌中表达。Western blotting检测到pEGFP-BCL10重组质粒在vero细胞中表达。结论表明,BCL10基因在鸡体内存在,该基因的重组质粒能在大肠杆菌和vero细胞中表达。 相似文献
14.
猪生成抑制素(MSTN) cDNA的克隆 总被引：3，自引：1，他引：2
从猪的肌生成抑制素(MSTN)编码序列中设计引物,以军牧一号猪肌细胞总RNA为模板,利用RT-PCR和嵌套PCR技术,扩增出MSTNcDNA片段.该片段全长1277bp,包含猪MSTN基因的全部编码序列.将所得片段与pMD18-T载体连接,转化到JM109大肠杆菌中,成功地筛选到阳性克隆,其质粒测序结果与文献报道的一致.经EcoRⅠ和PstⅠ酶解分析,cDNA片段与pMD18-T载体之间既有正向插入的克隆,也有反向插入的克隆,所得到的MSTNcDNA可用于原核和真核表达载体的构建. 相似文献
15.
以大肠杆菌E．coli ATCC25922株的染色体DNA为模板,PCR扩增AcrA蛋白部分基因,获得约691bp的DNA片段。将PCR产物克隆至pMD18-T载体中测序,并进一步将acrA亚克隆于pET28a原核表达载体中,进行该基因的诱导表达。表达的产物经SDS-聚丙酰胺凝胶电泳分析,可见一条约33ku的特异性蛋白条带。用纯化的acrA基因原核表达产物免疫獭兔,ELISA法检测不同时期獭兔抗体效价。蛋白质印迹结果表明,用表达的AcrA蛋白制备的acrA抗体能够用于检测大肠杆菌AcrA蛋白的表达水平。 相似文献
16.
通过电子克隆手段,克隆到大小为959 bp的cDNA序列.然后从鸡的脾脏提取RNA,用RT-PCR方法扩增出目的片段.将该片段连接到原核表达栽体pET-32a和真核表达载体pEGFP-C1中,采用SDS-PAGE检测原核表达载体pET-BCL10在大肠杆菌中的表达,脂质体转染法将真核表达载体pEGFP-BCL10转入vero细胞,Western blotting检测其在细胞中的表达.结果显示,PCR扩增到735 bp的DNA片段,原核表达载体和真核表达栽体经双酶切和核酸测序表明载体构建成功.SDS-PAGE电泳检测到pET-BCL10重组质粒在大肠杆菌中表达.western blotting检测到pEGFP-BCL10重组质粒在veto细胞中表达.结论表明,BCLl0基因在鸡体内存在,该基因的重组质粒能在大肠杆菌和vero细胞中表达. 相似文献
17.
鹅细小病毒VP3基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达 总被引：2，自引：0，他引：2
根据已发表的鹅细小病毒(GPV)B株核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增GPV吉林分离株主要结构蛋白VP3基因,获得大小为1605bp的核苷酸片段。将该片段纯化后克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌JM109,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。经过酶切和连接反应,将VP3基因克隆入真核表达载体pVAX1,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行了PCR和酶切鉴定。通过脂质体法将pVAX1-VP3转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光法检测。结果显示,VP3基因克隆成功,与GPVB株核苷酸序列同源性为96.2%;PCR和酶切鉴定结果证实,成功构建了含VP3基因的GPV真核表达载体pVAX1-VP3。提取转染该质粒的Vero细胞RNA,RT-PCR扩增,在1000～2000bp可见一明显DNA条带;间接荧光抗体染色转染细胞,在细胞表面可见特异荧光。 相似文献
18.
利用SacⅠ、HindⅢ限制性内切酶分别对pMG36e与pMD19-T-E0进行双酶切,将目的基因E0整合入穿梭表达载体pMG36e,构建牛病毒性腹泻病毒E0基因重组表达质粒pMG36e-E0。提取重组质粒pMG36e-E0,进行双酶切鉴定及PCR鉴定。将阳性重组质粒pMG36e-E0转化到大肠杆菌DH5α中进行表达,对表达产物进行SDSPAGE和Western-blotting鉴定。用表达的E0蛋白二次免疫家兔,间接ELISA法检测其血清抗体水平。结果,重组质粒经双酶切得到大小分别约为3 600、691bp的2个片段,PCR扩增出691bp的片段,双酶切与PCR鉴定结果表明目的基因E0正确插入到载体pMG36e中。SDS-PAGE电泳结果表明E0基因在大肠杆菌获得了表达,表达产物相对分子质量大小约为27 000。Western-blotting分析结果证明表达产物能被BVDV阳性血清所识别。ELISA检测结果证明表达的E0融合蛋白能刺激动物产生抗体,具有天然蛋白的免疫原性。 相似文献
19.
首先提取采自甘肃玛曲的皮蝇一期幼虫的总RNA,合成cDNA,根据设计的特异引物,利用PCR技术扩增出Hypodermin A(HA)基因片段,将此片段与PGEM-T Easy载体连接,构建克隆载体PGEM-HA,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,进行测序与分析。结果表明,扩增的HA基因长678bp,编码229氨基酸。克隆到的基因序列与NCBI GenBank上登陆的皮蝇HA基因序列核甘酸同源性为96.6%,推导氨基酸同源性达97.8%。该基因的成功克隆为其进一步表达打下了坚实的基础。 相似文献
20.
提取亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒总RNA，用特异性引物通过RT—PCR反应获得了约750bp的核酸片段，将其与pGEM—T Easy载体连接，并转化大肠埃希氏菌JM109。重组质粒经PCR、酶切鉴定及测序，证明所克隆的片段含有完整的VP1基因；将重组质粒与表达载体pcDNA3．1( )分别用Barn HⅠ和Eco RⅠ双酶切后连接，构建成重组表达质粒，转化宿主菌DH5α，筛选阳性克隆。测序结果证明，目的基因正确插入到表达载体中，命名为pcDNAV；用同样方法将IL-18基因插入pcDNAV中，命名为pcDNAVI。用pcDNAVI免疫豚鼠，2周后加强免疫1次，每周用ELISA检测豚鼠血清中的抗体水平。结果表明，pcDNA VI可引发机体产生体液免疫。 相似文献